加速溶剂萃取－超高效液相色谱－串联质谱法测定沉积物中的8种环境内分泌干扰物

张蓓蓓，赵永刚

（江苏省环境监测中心，国家环境保护地表水环境有机污染物监测分析重点实验室，南京210036）

加速溶剂萃取－超高效液相色谱－串联质谱法测定沉积物中的8种环境内分泌干扰物

张蓓蓓，赵永刚

（江苏省环境监测中心，国家环境保护地表水环境有机污染物监测分析重点实验室，南京210036）

取经前处理后的沉积物样品（5.000g）与中性氧化铝粉25g充分混匀，按规定条件用丙酮－甲醇（1＋1）混合液进行加速溶剂萃取其中的8种内分泌干扰物。所得萃取液吹氮浓缩至2mL，加水400mL并调节pH至3，溶液经HLB固相萃取小柱净化。小柱用氮气吹干后，用丙酮8mL洗脱。洗脱液经处理后进行超高效液相色谱－串联质谱分离。以BEH C18柱为固定相，以不同体积比的甲醇和0.1%（体积分数）氨水溶液为流动相进行梯度洗脱。在质谱分析中，采用电喷雾负离子源和多反应监测模式。8种化合物的质量浓度在2.0～100.0μg·L－1范围内呈线性，检出限（3s）在0.03～0.05μg·kg－1之间。按标准加入法在3个浓度水平上进行回收试验，回收率在62.8%～104%之间，测定值的相对标准偏差（n＝6）在2.8%～15%之间。

超高效液相色谱－串联质谱法；加速溶剂萃取；沉积物；内分泌干扰物

环境中的雌激素（EEs）及烷基酚类化合物（APs），作为典型的环境内分泌干扰物（EDs），其致害机制和监测分析是目前全球热点问题。雌激素大致可分为天然（内源）雌激素和人工合成（外源）雌激素两类。天然雌激素主要包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）和雌三醇（E3）等，E1和E3是E2的代谢产物，E2的活性最强，可通过生物体代谢释放到环境中。人工合成的雌激素，如双烯雌酚（DIE）、乙炔雌二醇（EE2）和己烯雌酚（DES）等，已用于经期综合症、荷尔蒙补充等方面的治疗或作为避孕药的主要成分，环境中这类雌激素多来源于人类服用药物后的排泄或者过期、废弃药物的随意丢弃。烷基酚类化合物是合成全球第二大类商用非离子表面活性剂烷基酚聚氧乙烯醚（APEOs）的原料，同时又是其降解的主要产物，主要包括被证实能对鱼类和其他水生生物产生雌激素效应的辛基酚（OP）和壬基酚（NP）。雌激素和烷基酚均为脂溶性物质，具有较强的疏水性，且化学性质稳定，不易自然降解，容易富集在污泥中，再随污泥排放进入环境中，成为纳污水域鱼类和其他水生生物的暴露源，从而被浮游生物摄取，在生物体内积累，并通过食物链的循环进入人体［1－2］。

关于雌激素和烷基酚类化合物，文献报道的分析方法主要有液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）［3－5］和气相色谱－质谱法（GC－MS）［6－8］等。由于两类化合物均具有不易挥发的特点，采用GC－MS测定时需要进行衍生化，以改善色谱峰形，提高灵敏度，前处理过程相对繁琐，对测定结果的精确度和重现性有一定影响；而LC－MS／MS无需衍生处理即可实现雌激素和烷基酚类化合物的同时测定，且灵敏度和定性能力均具有较大优势。本工作通过加速溶剂萃取法（ASE）对沉积物样品进行萃取富集，采用超高效液相色谱－串联质谱法（UHPLC－MS／MS）进行分离和定量，实现沉积物中8种化合物的同时定性定量分析。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Aquity／TQD型超高效液相色谱－串联质谱仪；Masslynx 4.0工作站；Supelco固相萃取装置，Waters HLB固相萃取柱（500mg）；Dionex ASE 300型加速溶剂萃取仪；LABCONCO型真空冷冻干燥机；Zymark型氮吹浓缩仪；Millipore型纯水机；0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜，0.22μm针头过滤器。

混合标准储备溶液：1.00g·L－1，分别称取雌三醇、乙炔雌二醇、17－α－雌二醇、17－β－雌二醇、雌酮、己烯雌酚、4－正－壬基酚、4－n－辛基酚等8种标准品各0.050 0g于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。于4℃避光保存。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

内标储备溶液：200mg·L－1，分别称取雌三醇－D3、17－β－雌二醇－D2、己烯雌酚－D8、雌酮－D4、乙炔雌二醇－D4、17－α－雌二醇－D2、4－n－壬基酚－13C6等7种同位素内标物标准品各0.010 0g于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。于4℃避光保存。使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

雌三醇（E3，纯度99.5%）、17－α－雌二醇（17－α－E2，纯度99.0%）、17－β－雌二醇（17－β－E2，纯度97.5%）、乙炔雌二醇（EE2，纯度99.0%）、雌酮（E1，纯度99.5%）、己烯雌酚（DES，纯度99.5%）、4－正－壬基酚（4－n－NP，纯度99.3%）、4－n－辛基酚（4－n－OP，纯度99.5%）、雌三醇－D3（E3－D3，纯度98.0%）、17－β－雌二醇－D2（17－β－E2－D2，纯度98.0%）、己烯雌酚－D8（DES－D8，纯度98.0%）、雌酮－D4（E1－D4，纯度98.0%）、乙炔雌二醇－D4（EE2－D4，纯度99.0%）、17－α－雌二醇－D2（17－α－E2－D2，纯度99.0%）、4－n－壬基酚－13C6（4－n－NP－13C6，纯度99.5%）均为一级标准物质；甲醇、丙酮、二氯甲烷为色谱纯；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1）加速溶剂萃取条件 萃取剂为丙酮－甲醇（1＋1）混合液；温度80℃；压力10MPa；预加热1min，加热时间4min；静态萃取时间5min；冲洗体积为60%萃取池体积；采用2个萃取循环。

2）色谱条件 BEH C18色谱柱（50mm× 2.1mm，1.7μm）；柱温30℃；流量0.3mL· min－1；进样量10μL；流动相A为0.1%（体积分数，下同）氨水，B为甲醇。梯度洗脱程序：0～2min时，B由50%升至60%；2～4min时，B由60%升至95%，保持1min；5.0～5.1min时，B由95%跳转至50%，保持1min。

3）质谱条件 电喷雾离子源，负离子扫描方式（ESI－），多反应监测（MRM）模式；离子源温度120℃；毛细管电压－2.8kV；脱溶剂温度450℃；脱溶剂气和锥孔气为氮气，脱溶剂气流量850L· h－1，锥孔气流量50L·h－1；碰撞气为氩气，流量0.13mL·min－1。多反应监测条件碎片解析见表1，其中“＊”为定量离子。

1.3 试验方法

用不锈钢抓斗式采泥器在宜兴太湖采集了11个表层沉积物样品（0～20cm），每个样点采集至少1kg的泥样，样品采集后放入洁净的棕色玻璃瓶中加盖密封，立即运回实验室，于－20℃下保存至分析。

表1 质谱参数Tab.1 MS parameters

沉积物样品经冷冻、干燥、磨细过0.425mm（40目）筛后，称取磨细后的沉积物样品5.000g，与中性氧化铝粉末25g充分混匀后转移至33mL加速溶剂萃取池内。最后将萃取液倒入吹氮管中吹氮浓缩至2mL。

将上述萃取液加水400mL溶解，用盐酸调节pH至3，采用HLB固相萃取小柱进行样品净化。上样前，HLB柱依次用甲醇6mL、水6mL活化平衡；待净化样品上样速率为3～5min·mL－1；上样结束后，用氮气吹干小柱后，用丙酮8mL洗脱。洗脱液经氮气吹至约0.5mL，加入甲醇5mL混匀后吹氮浓缩至0.5mL以下，用甲醇定容至0.5mL，加水0.5mL、混合内标溶液10μL，混匀后过0.22μm滤膜，按UHPLC－MS／MS条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

试验采用ESI－方式测定8种目标物，为了获得最佳分离效果和较好的灵敏度，分别考察了甲醇－水、甲醇－0.1%（体积分数，下同）氨水溶液、甲醇－0.1mmol·L－1乙酸铵溶液为流动相对目标物分离的影响，结果见图1。

图1 8种目标物及7种内标物总离子流图Fig.1 TIC chromatogram of 8target compounds and 7internal standards

由图1可知：水相中添加氨水，提高了大部分目标物的响应，同时通过调节流动相梯度，除EE2、E1、17－β－E2等目标物未能获得分离外，其余5个目标物均在短时间内获得了基本或完全分离，且色谱峰形对称、尖锐。因质谱检测器采用的是多离子反应监测模式，对未达到基本分离的目标化合物也能进行准确的定性定量分析，不影响分析结果，因此试验选择甲醇－0.1%氨水溶液为流动相。

2.2 质谱条件的选择

对1mg·L－1的8种目标物单标准溶液在ESI＋／ESI－及大气压力化学电离源APCI＋／APCI－等4种方式下进行一级质谱母离子扫描，结果表明：在ESI－方式下目标物有更好的响应，基峰均为［M－H］－。优化母离子锥孔电压后，选择［M－H］－为母离子，进行二级质谱扫描，寻找子离子碎片，确定定量离子和定性离子及其最佳碰撞能量，以达到最佳的检测灵敏度。目标物的二级质谱全扫描图和裂解途径见图2。

图2 8种目标物的二级质谱图及裂解途径Fig.2 MS／MS spectra of 8target compounds and the possible fragmentation mechanism

2.3 加速溶剂萃取条件的选择

试验分别采用丙酮、甲醇、二氯甲烷及丙酮－甲醇（1＋1）混合液作为萃取剂对沉积物进行加速溶剂萃取，比较不同有机溶剂的提取效率，结果见图3。

图3 不同萃取溶剂对8种目标物的萃取效率Fig.3 Extraction efficiency of various extraction solvents for 8target compounds

由图3可知：对于8种目标物，丙酮、甲醇及丙酮－甲醇（1＋1）混合液的萃取效率差别不大，其中丙酮－甲醇（1＋1）混合液的萃取效率略高，而二氯甲烷对于雌激素类目标物的萃取效率较差。试验选择丙酮－甲醇（1＋1）混合液为萃取剂。

2.4 标准曲线与检出限

用甲醇（1＋1）溶液配制8种目标物质量浓度依次为2.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0μg·L－1的混合标准溶液，取标准溶液1.0mL置于进样瓶中，均加入10μL混合内标溶液，混匀。以目标物的质量浓度为横坐标，以目标物与内标物定量离子的峰面积比为纵坐标绘制标准曲线。8种目标物的质量浓度在2.0～100.0μg·L－1范围内呈线性，其线性参数见表2。

按试验方法对7份加标空白沉积物样品进行测定，根据HJ 168－2010方法检出限测定要求，以3倍的标准偏差为检出限（3s），4倍检出限为测定下限，结果见表2。

由表2可知：8种目标物的检出限为0.03～0.05μg·kg－1，方法灵敏度高，满足沉积物中该类痕量污染物检测要求。

2.5 精密度及回收试验

取空白沉积物样品，在5.0，10，50μg·kg－1等3个水平上做加标回收试验，结果见表3。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表3 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab.3 Results of tests for precision and recovery

由表3可知：8种化合物的回收率在62.8%～104%之间，测定结果的相对标准偏差（RSD）在2.8%～15%之间。方法的准确度和精密度均符合痕量分析的要求。

2.6 环境样品分析

按试验方法对宜兴地区太湖流域11个监测点的沉积物样品进行分析，其测定结果见表4，其中“－”表示未检出。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of samples

由表4可知：宜兴太湖沉积物中6种雌激素的总质量分数为0.08～2.54μg·kg－1，其中E1检出率最高，其次为17－β－E2，总体来说，宜兴太湖沉积物中雌激素的含量与国内外文献［9－15］报道相比，处于偏低水平；烷基酚4－n－OP和4－n－NP均有检出，其中4－n－NP检出率为100%，4－n－NP含量明显高于4－n－OP，且这两种目标物在不同的监测点位上具有同步增减的趋势，这与国外相关文献［9］检测结果相似。

本工作建立了加速溶剂萃取－超高效液相色谱－串联质谱法同时测定沉积物中雌激素和烷基酚的方法。该方法具有灵敏度高、准确、重现性好的特点，可满足环境样品的监测要求。

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《分析测试统计方法和质量控制》书讯

曹宏燕等编著。

《分析测试统计方法和质量控制》全书分十三章，七十三万余字，介绍了分析测试及其试验研究中常用的数理统计方法，包括误差和误差的分布、统计检验、方差分析、正交设计、回归分析等统计方法的理论与实践。

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书号：ISBN 978－7－122－27707－7；开本：16开；定价：98元；出版日期：2017年1月；出版社：化学工业出版社出版。

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联系人：王敏先生。

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ASE－UHPLC－MS／MS Determination of 8Environmental Endocrine Disrupters in Sediments

ZHANG Bei－bei，ZHAO Yong－gang
（State Environmental Protection Key Laboratory of Monitoring and Analysis for Organic Pollutants in Surface water，Environment Monitoring Center of Jiangsu Province，Nanjing210036，China）

The pretreated sediment sample（5.000g）was mixed thoroughly with neutral Al2O3（25g），and 8 endocrine disrupters in the sample were separated by ASE as described with a mixture of acetone and methanol（1＋1）.The extract was concentrated to 2mL by N2－blowing，400mL of water were added and acidity of the solution was adjusted to pH 3.The solution was then purified by passing through HLB－SPE column.After drying the column by N2－blowing，it was eluted with 8mL of acetone.The treated eluate was separated by UHPLC using BEH C18column as the stationary phase，and mixtures of methanol and 0.1%（φ）ammonia solution，mixed in various volumic ratios，as mobile phase in gradient elution.ESI－and MRM were adopted in MS.Linear relationships between values of peak area and mass concentration of 8compounds were found in the range of 2.0－100.0μg· L－1，with detection limits（3s）in the range of 0.03－0.05μg·kg－1.Test for recovery was made by standard addition method at 3concentration levels，giving results in the range of 62.8%－104%，with RSDs（n＝6）ranged from 2.8%to 15%.

UHPLC－MS／MS；ASE；Sediments；Endocrine disrupters

O657.63

A

1001－4020（2017）04－0418－07

10.11973／lhjy－hx201704010

2016－03－23

江苏省环境监测基金项目（1305）

张蓓蓓（1982－），女，江苏东台人，高级工程师，硕士，主要从事环境中有毒有害污染物监测工作。E－mail：zbb＠jshb.gov.cn