HPV阳性患者基因分型及病毒负载量分析

翁洁玲， 汤涛， 彭俊玲， 张晓， 张旭， 王芳*

（1广州医科大学附属第二医院 病理科，广东 广州510260；2中山大学肿瘤防治中心 分子诊断科，广东 广州510060）

HPV阳性患者基因分型及病毒负载量分析

翁洁玲1， 汤涛2， 彭俊玲2， 张晓2， 张旭2， 王芳2*

（1广州医科大学附属第二医院 病理科，广东 广州510260；2中山大学肿瘤防治中心 分子诊断科，广东 广州510060）

目的 研究广州地区宫颈人乳头状瘤病毒 （HPV）的感染状况及基因型分布，并探讨病毒负载量与宫颈鳞状上皮内病变的关系。方法 收集中山大学肿瘤防治中心2013年7月至2015年10月收治的1 105名女性的宫颈刷取物标本，采用表面等离子体谐振技术 （SPR）检测HPV型别及负载量，同时行宫颈液基细胞学检查 （LCT）。细胞学检查阳性患者加做阴道镜及病理活检。结果 共检测出HPV阳性标本210例，感染率为19.00%。共检出23个基因型，包括16个高危型 （HR-HPV）和7个低危型 （LR-HPV）。单一高危型169例 （15.29%），平均负载量为 （170.59±85.91）m°；单一低危型20例 （1.81%），平均负载量为 （111.75±37.39）m°；HPV多重感染21例 （1.90%）。单一HR-HPV阳性患者的平均病毒负载量显著高于阴性患者，差异有统计学意义 （Z＝-3.256，P＝0.001）。结论 SPR和LCT联合检测有助于宫颈癌前病变的诊断，对进一步临床治疗有指导意义。

人乳头状瘤病毒；基因型；宫颈鳞状上皮内病变；表面等离子体谐振；液基细胞学检测

继乳腺癌和结直肠癌之后，宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤［1］。 流行病学研究［2］已证明， 宫颈癌的发生与高危型人乳头状瘤病毒 （HR－HPV）感染和宫颈癌筛查的缺乏有关。与其他癌症相比，宫颈癌的筛查是最有成效的。目前最常用的两种筛查方法是宫颈液基细胞学检查 （LCT）和HPV－DNA检测。本研究采用表面等离子体谐振法 （SPR）对HPV进行基因分型并对病毒负载量进行检测，同时对患者行LCT，旨在探讨HRHPV病毒负载量与宫颈鳞状上皮内病变之间的关系，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集中山大学肿瘤防治中心2013年7月至2015年10月期间收治的1 105名女性的宫颈刷取物标本。其中HPV阳性患者210名，年龄20～72岁，平均年龄 （43.42±10.08）岁。

1.2 方法

1.2.1 宫颈脱落细胞采集和处理

采用美国BD公司SUREPATH专用采样刷收集宫颈鳞柱交界处脱落细胞，用于HPV分型及LCT检测。

1.2.2 HPV基因分型检测

使用北京金菩嘉医疗科技有限公司的 SPR技术及配套W2600型生物传感阅读仪进行HPV基因分型及负载量检测。反应体系包括89 μL扩增混合液、1 μL Taq酶及10 μL DNA样本，PCR反应条件：50℃2 min，94℃4 min；94℃30 s，48℃45 s，72℃20 s，28个循环；94℃30 s，65℃45 s，72℃20 s，25个循环；4℃终止。向每管扩增产物中加入60 μL杂交缓冲液，95℃变性3 min，与SPR生物传感芯片反应，通过软件对结果进行分析判读。该检测包括24个HPV亚型，其中高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81。低危型包括 6、11、40、42、43、44、54、70。结果检测值≥40 m°则为阳性。阳性结果提示该样本的病毒检测量>1 pg／μL标准品 （相当于>106／mL样本病毒质粒拷贝数）。

1.2.3 宫颈液基细胞学

LCT结果按照子宫颈细胞学2001版TBS分为无上皮内病变或恶性病变 （NILM）、不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）、不除外高级别鳞状上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞 （ASC－H）、低级别鳞状上皮内病变 （LSIL）、高级别鳞状上皮内病变 （HSIL）及鳞状细胞癌 （SCC）。除NILM外，其他病例均属于LCT阳性患者。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行分析处理，计量资料的比较采用Mann－Whitney U方法，多组计量资料的比较采用Kruskal－Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染阳性率

受检的1 105例女性标本中，HPV感染阳性共210例，阳性率为19.00% （见表1）。共检测出23个HPV亚型，包括16个高危型 （HR－HPV）和7个低危型 （LR－HPV）。单一高危型共169例，占全部阳性标本的80.48%，其中前三位为HPV52、16、53，分别为27例、26例、15例。单一低危型20例，占全部阳性标本的9.52%，其中前三位为HPV54、70、6，分别为7例、7例、3例。HPV多重感染共21例，占全部阳性标本的10.00%，其中18例为双重感染。双重感染患者中15例为同时感染2种高危型，3例为高危及低危混合感染。

表1 HPV单一及多重感染阳性检出率比较

2.2 LCT结果及病理活检结果

210例HPV阳性患者中，有155例经LCT诊断为NILM；LCT阳性共55例，包括16例ASC－US、2例ASC－H、19例LSIL、16例HSIL和2例SCC。LCT阳性患者病理活检结果显示有3例为慢性宫颈炎，30例为CINⅠ级，20例为CINⅡ／Ⅲ级，2例为低分化鳞状细胞癌 （见表2）。30例CINⅠ级共检出11种高危型 （其中检出9例HPV66和5例HPV52）和2种低危型。20例CINⅡ／Ⅲ级患者共检出7种高危型，其中6例为HPV16（5例单一型及1例合并HPV58）。2例SCC患者均为HPV16（1例单一型，另1例合并HPV81）。

表2 LCT阳性患者HPV基因分型及宫颈病理活检结果

2.3 高危型HPV负载量与LCT及病理活检结果的相关性

NILM组及 LCT阳性组患者的平均病毒负载量分别为159.64 m°和198.19 m°，差异具有统计学意义 （Z＝－3.118，P＝0.002）。ASC组、LSIL组和HSIL组患者的平均病毒负载量分别为200.27 m°、209.33 m°和184.43 m°，组间比较差异无统计学意义 （χ2＝0.885，P＝0.643）。将经LCT诊断为NILM的155例患者和病理活检为慢性宫颈炎的3例患者均归入阴性组。病理阳性组、CINⅠ级组及CINⅡ／Ⅲ级组患者的平均病毒负载量分别为200.41 m°、197.63 m°和204.90 m°，均高于阴性组的

159.77 m°（Z值分别为－3.256、－2.441和－2.337，对应的P值分别为0.001、0.015和0.019）。而CINⅠ级组与CINⅡ／Ⅲ级组的平均病毒负载量比较，差异并无统计学意义 （Z＝－0.178，P＝0.859）。

3 讨论

在人类所有的癌症中，15%的癌症是由病毒感染引起的，宫颈癌是其中之一［3］。1977年，Harald zur Hausen首次提出HPV与宫颈鳞状细胞癌有关［2］，并因此荣获2008年度诺贝尔医学奖。HPV属于乳头状瘤病毒科，是双链DNA病毒，长约8 000个碱基对，目前已发现并鉴定出100多种亚型，其中40余种与人类生殖器皮肤黏膜病变相关。HPV主要感染皮肤和黏膜，并引起感染部位上皮的增生，增生的上皮或乳头状瘤在某些情况下具有癌变的可能。根据致癌风险的高低不同，HPV的型别大致可分为高危型 （HR－HPV）和低危型 （LR－HPV）。HR－HPV是几乎所有宫颈癌发生发展的必要非充分条件［4］。其中HPV16最具致癌风险，全世界55%～60%的宫颈癌病例［5］为HPV16感染者。HPV感染的类型及各类型所占比例因地域或人种的差异而有所不同。本研究中我院体检的总体HPV感染阳性率为19.00%，居于中间水平。不同地区感染率的差异，可能与不同地区的经济水平、开放程度以及不同的研究人群有关。本研究结果显示，HPV多重感染占HPV阳性例数的10.00%，明显低于Bachtiary等[6]报道的43.7%，亦低于成都地区 （24.3%）及厦门地区 （19.2%），且多重感染仍以二重感染为主。本研究检出的210例HPV阳性患者中共有23个亚型，包括16个高危型和11个低危型。其中52型、16型和53型是最常见的三种高危型，与万敏等［7］的报道具有一致性。本研究中的2例SCC患者均感染HPV16，且20例CINⅡ／Ⅲ级患者中有6例感染HPV16。

浸润性宫颈癌存在前驱病变［8］，高级别的宫颈上皮内病变一般需要3～7年的时间才发展成浸润性宫颈癌［9］。学者们试图找出使宫颈癌前病变发展成为宫颈癌的各种影响因素，其中HPV病毒负载量与宫颈癌发展过程的组织学分级的关系目前仍然存在争议。杨娟等［10］的研究提出，CINⅠ级组、CINⅡ／Ⅲ级组及SCC组与HPV病毒负载量呈正相关。Shen等［11］采用半定量的方法得出宫颈病变程度与HPV病毒负载量呈正相关。宫颈炎组、宫颈上皮内瘤变 （CIN）组和宫颈癌组的HPV病毒负载量呈上升趋势。本研究结果显示，单一HR-HPV阳性患者的平均病毒负载量均显著高于阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。而CINⅠ级组与CINⅡ／Ⅲ级组的平均病毒负载量比较差异无统计学意义 （P＞0.05）。何惠华等［12］对孝感地区的7 780名妇女同时行 TCT及 HPV联合检测，结果表明，随着HPV平均病毒负载量的增大，患者的宫颈病变程度越严重。本研究的LCT结果并未发现ASC组、LSIL组和HSIL组的HPV平均病毒负载量存在类似关系。

HPV阳性、LCT阴性的患者大部分为一过性感染，加强随访更有利于了解病情的转归。患者更愿意选择观察随访而非做阴道镜加病理活检的有创性检查。本研究均为常规体检患者，鳞状细胞癌例数较少，因此不单独列出一组进行讨论。

综上所述，本研究结果提示，HPV病毒负载量与宫颈鳞状上皮内病变的发生具有相关性，而对于病变的发展无预测作用。SPR和LCT联合检测有助于宫颈癌前病变的诊断，对临床进一步治疗有指导意义。

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[4]Tota JE,Chevarie-Davis M,Richardson LA,et al.Epidemiology and burden of HPV infection and related disease：implications for preven tion strategies[J].Prev Med,2011,53(Suppl 1)：S12-S21.

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[7]万敏,赵金银,曲守方,等.基质辅助激光解析、电离飞行时间质谱法和表面等离子谐振法在HPV分型检测中的应用比较 [J].中国计划生育学杂志,2014,22(3)：178-181.

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[9]Schlichte MJ,Guidry J.Current cervical carcinoma screening guidelines [J].J Clin Med,2015,4(5)：918-932.

[10]杨娟,肖兰,杨继洲.高危型HPV负载量与宫颈癌前病变发展的相关性 [J].实用癌症杂志,2012,27(6)：656-657.

[11]Shen G,Cheng J,Wang Y,et al.Viral DNA load of high-risk human papilloma virus is closely associated with the grade of cervical lesions [J].Int J Clin Exp Med,2014,7(12)：5826-5831.

[12]何惠华,刘汉忠,李蓓,等.孝感地区7780例TCT与HPV联合检测分析 [J].临床与病理杂志,2015,35(2)：258-262.

（责任编辑：常海庆）

Analysis on Genotypes and Viral Load of Patients with Human Papillomavirus

WENG Jieling1,TANG Tao2,PENG Junling2,ZHANG Xiao2,ZHANG Xu2,WANG Fang2*
(1Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,China;2Department of Molecular Diagnosis,Sun Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,China;*

WANG Fang,E-mail:wangfang@sysucc.org.cn)

ObjectiveTo study the infection and genotype distribution of uterine cervix human papillomavirus(HPV)in Guangzhou, and to explore the relationship between viral load and cervical squamous intraepithelial lesion.Methods 1 105 cases of women admitted to the Sun Yat-sen university cancer center from July 2013 to October 2015 were selected,and their cervical specimens were collected.The HPV genotypes and viral load were detected by surface plasmon resonance(SPR)and liquid-based cytology test(LCT).Patients with positive cytology test then

colposcope and cervical biopsy.Results 210 cases of positive HPV specimens were detected and the infection rate was 19.00%.23 genotypes were detected,including 16 high-risk HPV(HR-HPV)genotypes and 7 low-risk HPV(LR-HPV) genotypes.Among 1 105 cases,169 cases(15.29%)were single HR-HPV genotypes and the average viral load was(170.59±85.91)m°;20 cases(1.81%)were single LR-HPV genotypes and the average viral load was(111.75±37.39)m°;21 cases(1.90%)had multiple HPV infection.The average viral load of patients with positive single HR-HPV was significantly higher than that of negative patients,with statistical difference(Z=-3.256,P=0.001).Conclusions SPR combined with LCT can help for diagnosis of cervical precancerous lesions, which has guiding significance for further clinical treatment.

Human papillomavirus(HPV);Genotype;Cervical squamous intraepithelial lesion;Surface plasmon resonance(SPR); Liquid-based cytology test(LCT)

R737.33

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.05.0608

2016－10－21

2017-03-15

翁洁玲 （1981－），女，硕士学位，主治医师，从事临床病理诊断工作。

*通讯作者：王芳，病理主治医师，E-mail：wangfang@sysucc.org.cn。