钩吻生物碱化在不同湿热灭菌条件下的成分动态变化

黄美霞 洪怀山 廖华军 王英豪 李德森 吴水生*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；2. 福建省立医院/福建省立金山医院，福建 福州 350028



药物研究

钩吻生物碱化在不同湿热灭菌条件下的成分动态变化

黄美霞1洪怀山2廖华军1王英豪1李德森1吴水生1*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108；2. 福建省立医院/福建省立金山医院，福建 福州 350028

目的：探讨钩吻生物碱类化学成分随湿热灭菌条件的变化规律。方法：采用高压蒸汽灭菌、低温间歇灭菌等不同条件，将钩吻藤茎粉末进行湿热灭菌，用HPLC法对灭菌前后的化学成分中的钩吻碱甲、钩吻素子、钩吻素己、胡蔓藤碱乙的含量进行监测。结果：60℃，70℃灭菌3次，钩吻生物碱成分含量未见明显变化，钩吻碱甲在各灭菌条件下较稳定。钩吻素己80℃灭菌4次分别降低29.3%，28.2%，26.4%，32.8%，其余生物碱影响不大；90℃灭菌4次，钩吻素子分别降低8.5%，15.4%，15.4%，17.4%；钩吻素己分别降低32.8%，48.3%，55.2%，56.9%；胡蔓藤碱乙降低了1.3%，12.7%，12.7%，11.9%；121℃，21min高压灭菌对钩吻多种生物碱成分的破坏均较大，其中钩吻素己含量降低多达89%。结论：钩吻生物碱受湿热温度影响较大，其中钩吻素己最显著，80℃间歇灭菌4次是保证对钩吻灭菌较彻底且破坏性最低的灭菌方法。

钩吻；灭菌温度；生物碱；含量；HPLC

钩吻Gelsemiumelegans(Gardn. et Champ.) Benth.系马钱科Loganiaceae钩吻属Gelsemium植物[1]。因其具有剧毒，自古以来又被称为断肠草。钩吻有2种，北美钩吻，有剧毒，主要分布于美洲；中国钩吻，产于亚洲，主要分布在福建，江西，浙江，湖南等地[2-3]。研究表明，钩吻具有抗肿瘤、镇痛、免疫调节、抗炎、抗应激等药理作用。生物碱是其主要活性成分，同时也是其主要的毒性成分[4-6]，这给广大研究人员带来了严峻的挑战与机遇。课题组采用炮制、配伍、双向固体发酵[7-8]等方式对钩吻进行系列减毒研究。并发现钩吻碱甲，钩吻素子，钩吻素己，胡蔓藤碱乙4种生物碱类化学成分在发酵前后含量发生了显著变化。因双向固体发酵的设计为基于纯种菌的发酵，因此发酵前对钩吻药材进行了必要的灭菌环节，实验发现上述生物碱的含量不仅受发酵过程影响，且受灭菌温度、湿度影响显著，笔者报道不同湿热条件下，钩吻主要化学成分的含量变化，为钩吻的减毒研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；岛津 LC solution工作站、DV215CD 型1/10万分析天平(奥豪斯公司) ；Milli-Q 型超纯水仪(美国Millipore)；高压蒸气灭菌锅(北京发恩科贸有限公司)。

1.2 材料 乙腈(色谱纯，德国MERCK公司)；95%乙醇，三乙胺，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。钩吻(生品)采集于福建省宁德市霞浦县，经福建中医药大学大学杨成梓教授鉴定为马钱科胡蔓藤属植物Gelsemium elegans (Gardn. et Champ.) Benth.。

2 方法

2.1 样品制备

2.1.1 高压蒸汽灭菌样品制备 平行称取3份干燥的钩吻粉末10g，粉碎(过10目筛)，装入三角锥形瓶，加20mL水浸润至透，加清洁棉塞，牛皮纸扎口。0.2 MPa蒸汽，121℃灭菌20min。放凉后，置于湿度90%，温度28℃培养箱内。

2.1.2 低温间歇灭菌样品的制备 平行称取干燥的钩吻藤茎10g，粉碎(过10目筛)，分别装入三角锥形瓶，加20mL 60、70、80、90℃蒸馏水浸润至透，加清洁棉塞，牛皮纸扎口。并分别置于60、70、80、90℃烘箱中1h，灭菌3次，80、90℃组分别灭菌4次，每2次灭菌时间间隔24 h，各个样品平行测定3份。每次灭菌后放凉并置于相对湿度90%，温度28℃培养箱内。2.2 样品的提取与前处理 取钩吻生品(GV)、灭菌钩吻(样品1～10)，分别用7倍量95%乙醇回流提取3次，合并提取液旋转蒸发回收溶剂，得到各样品浸膏。真空冷冻干燥，研碎称重，使用前用色谱甲醇溶解并定容至0.06g/mL(按药材计)。

2.3 对照品溶液的制备 精密成定钩吻碱甲(Gelsemine)、钩吻素子(Koumine)、钩吻素己(Gelsenicine)、胡蔓藤碱乙(Humantenine)，加入甲醇制备成分别含80.00、51.25、65.15、42.32μg/mL的对照品溶液。采用外标一点法对样品中个生物碱成分的含量进行测定。

2.4 色谱条件 色谱柱： 依利特Sino Chrome ODS-BP (4.6 mm ×250 mm，5μm) ；流动相：乙腈-0.3%磷酸+0.5%三乙胺水溶液；梯度洗脱： 0～40 min，乙腈10%～20%；40～80 min，乙腈20%～40%；80～85 min，乙腈40%～50%；85～90 min，乙腈50%～80%；90～95 min，乙腈80%～10%；95～100 min，乙腈10%～10%；体积流量：1 mL /min；柱温：40℃；检测波长：254 nm；进样量20 μL。

3 结果与讨论

3.1 高压蒸汽灭菌对钩吻生物碱的影响 钩吻的生物碱主要为吲哚型生物碱。在实验条件下，考察的四个钩吻生物碱分离度良好，基线稳定。如下图1所示。钩吻经121℃，0.2MPa、20min高压蒸汽灭菌后生物类化学成分显著降低，尤其是钩吻素己降低了89%，色谱峰几乎消失。钩吻碱甲，钩吻素己，胡蔓藤碱乙分别降低了4.5%、2.6%，20%。提示高温高压蒸汽灭菌对钩吻素己的破坏性极大，结果见图2。

3.2 不同灭菌温度对钩吻碱甲的影响 考察低温间歇灭菌对生物碱的影响，在所考察的四中生物碱中，钩吻碱甲在60、70、80、90℃温度条件下，含量均未发生明显变化，即使经过高压蒸汽灭菌含量也仅降低了4.5%，提示钩吻碱甲的热稳定性良好。结果见图3。

3.3 不同灭菌温度对钩吻素子、胡蔓藤碱乙的影响 钩吻素子在低温条件下含量变化较小，而在90℃灭菌第2次至第4次时，含量降低较明显，分别降低了15.4%、15.4%、17.4%，但三次灭菌之间并未见进一步降低。所考察的四种生物碱中，胡蔓藤碱乙的稳定性仅次于胡蔓藤碱甲。但在90℃第2～4次灭菌，含量分别降低12.7%、12.7%、11.9%，见图4a、4b。提示90℃灭菌2次起，对钩吻素子、胡蔓藤碱乙有一定的破坏性。3.4 不同灭菌温度对钩吻素己的影响 钩吻素己显示出了对湿热极不稳定，在各种灭菌条件下仅60～70℃略微降低，80℃起，含量分别下降了29.3%、28.2%、26.4%、32.8%，90℃条件下，含量分别降低了32.8%、48.3%、55.2%、56.9%；在高压灭菌121℃时，钩吻素己几乎完全被破坏，高达89%，实验结果显示钩吻素己热不稳定。实验结果如图5所示。实验亦发现，当温度到达80℃起，钩吻素己原本尖锐的单峰，裂解为2个较低并且不完全分离的色谱峰，提示化学结构的变化引起了极性变化。

4 结论

钩吻生物碱受湿热温度影响较大，其中钩吻素己最显著，80℃间歇灭菌4次是权衡对钩吻碱甲、钩吻素子、胡蔓藤碱乙、钩吻素己的破坏性最低并保证对钩吻灭菌较彻底的灭菌方法。

[1]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(下册)[M].北京:人民卫生出社,1983:118-121.

[2]黄庆彰,黄明. 胡蔓藤属植物、成分及毒理作用[J]. 广西卫生,1980,3:32-35.

[3]陈毅胜.中国有毒植物[M]. 北京:科学出版社,1990 :371-376.

[4]Gao Ming-Ya, Shen Wei-Zai, Wu Yan-Hui, et al. Study on anti-proliferation activity and the mechanisms of alkaloid monomers from Gelsemiumelegans on HepG2 cell in vitro [J]. Journal of ChinBese medicinal materials, 2012, 35(3):438-42.

[5]Xu YK, Liao SG, Na Z, et al. Gelsemium alkaloids, immunosuppressive agents from Gelsemium elegans[J]. Fitoterapia，2012, 83(6):1120-1124.

[6]Liu M，Huang H H，Yang J，et a1．The active alkaloids of Gelsemium elegans Benth are potent anxiolytics[J]．Psychopharmacology (Ber1)，2013，225(4)：839-851．

[7]吴水生,邱颂平,王英豪,等.不同炮制与配伍法减缓钩吻毒性及其机制的实验研究[C].//第五届全国临床中药学学术研讨会论文集，武汉，2012.

[8]庄毅.药用真菌新型(双向型)固体发酵工程[J].中国食用菌,2002,21(4):3-6.

Determination of Gelsemium Alkaloids and Its Dynamic Changes in Different Damp-heat Condition

HUANG Meixia1HONG Huaishan2LIAO Huajun1WANG Yinghao1LI Desen1WU Shuisheng1*

1. School of Pharmacy，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China; 2. Fujian Provincial Hospital /Fujian Provincial Jinshan Hospital，Fuzhou 350028，China

Objective To observe the dynamic changes of 4 Gelsemium Alkaloids before and after different damp-heat conditions. Methods Gelsemium elegans was Sterilization in high pressure exterminating and 4 kinds of low-temperature fractional sterilization. HPLC was used to determine the different changes of gelsemine, koumine, gelsenicine and humantenine before and after Sterilization. Results Contents of the four Gelsemium Alkaloids had no obvious change before and after 3 times of 60℃ or 70℃ sterilization, the content of gelsemine had no significantly change before and after all kinds of sterilization conditions. In the 4 times of 80℃ fractional sterilization, gelsenicine decreased 29.3%，28.2%，26.4%，32.8% respectively; And it had decreased 32.8%，48.3%，55.2%，56.9% in the 4 times of 90℃ fractional sterilization. Koumine had decreased 32.8%，48.3%，55.2%，56.9% while humantenine decreased 1.3%，12.7%，12.7%，11.9% in the 4 times of 90℃ fractional sterilization. All 4 alkaloids had decreased varying degrees in the high pressure exterminating of 121℃×20min. Conclusion Gelsemium Alkaloids were heat unstable, gelsenicine was especially heat sensitive, 4 times of 80℃ fractional sterilization can afford a kind of Sterilization that make the lowest damage of Gelsemium Alkaloids.

Gelsemium elegans; Sterilization temperature; Gelsemium Alkaloids; Content; HPLC

福建省科技厅项目(2015J01329)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题(20133519 110005)；2016年福州市食用菌产业发展项目。

黄美霞(1982-)，女，汉族，硕士，讲师，研究方向为中药药效物质基础与药理活性研究。E-mail:67657674@qq.com

吴水生(1965-)，男，汉族，博士，教授，博士生导师，研究方向为中药药效物质基础与作用机制研究。E-mail:498366498@qq.com

【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2017)09-0008-04

2017-02-24 编辑：陶希睿)