原儿茶酸与原儿茶醛对小鼠肝脏细胞色素P450表达的影响

张晓燕， 许海淼， 王笃军， 王 凯， 眭丹娟， 魏 渊

(江苏大学 药学院，江苏 镇江，212013)

原儿茶酸与原儿茶醛对小鼠肝脏细胞色素P450表达的影响

张晓燕， 许海淼， 王笃军， 王 凯， 眭丹娟， 魏 渊*

(江苏大学 药学院，江苏 镇江，212013)

目的：研究原儿茶酸和原儿茶醛对小鼠肝脏细胞色素P450酶主要亚型表达水平的影响。方法：将C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(0.9%生理盐水)、原儿茶酸与原儿茶醛给药组(6 mg/kg)，苯巴比妥诱导组(80 mg/kg)，每24 h给药一次，连续给药2周。提取肝脏中总RNA，RT-PCR技术考察药物对CYP450主要亚型mRNA 表达的影响；制备肝微粒体，用Western blot技术考察P450酶主要亚型的表达。结果：RT-PCR结果显示，在mRNA水平上，与正常对照组相比，原儿茶酸可诱导Cyp1a2基因的表达(P<0.05)，对Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表达无诱导作用。原儿茶醛对Cyp1a2的mRNA的表达有诱导作用(P<0.05)，对Cyp2c37和Cyp2d9的mRNA的表达无诱导作用。Western blot结果显示原儿茶酸对CYP1A2，CYP2E1表达有显著诱导作用，对其他几种亚型无影响。原儿茶醛对CYP1A2表达有显著诱导作用，对其他几种亚型无影响。Western blot结果与RT-PCR结果基本一致。结论：原儿茶酸与原儿茶醛均可以显著诱导CYP1A2的mRNA以及蛋白表达，并且原儿茶酸可以显著诱导CYP2E1的蛋白表达。

原儿茶酸；原儿茶醛；细胞色素P450；表达水平

原儿茶酸 (Protocatechuic acid) 是天然存在于许多蔬菜和果实中的一种酚酸类物质，并且是很多中药中的活性成分，如四季青[1]、丹参[2]、芙蓉[3]等。大量实验证明，原儿茶酸具有抗菌、抗氧化、抗炎、镇痛、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量以及神经保护等多方面药理作用，是一种重要的天然活性物质[4-8]。原儿茶醛 (Protocatechuicaldehyde) 存在于四季青、丹参、鼠尾草等中药中[9]。原儿茶醛有扩张冠状动脉、降低心肌氧耗量、抑制血小板聚集、抗肿瘤作用、清除自由基和抗脂质过氧化、抗炎等作用[10]。瘀血证患者单核细胞趋化游走能力增强，原儿茶醛抑制单核细胞趋化游走[11]和在趋化游走过程中产生的IL-8 活性[12]，因此，原儿茶醛是活血化瘀类中药中的重要活性成分之一。

细胞色素P450(Cytochrome P450)是肝微粒体混合功能氧化酶中最重要的一族，在外源性和内源性物质的代谢中起着极其重要的作用[13-14]。细胞色素P450可受多种因素的影响，尤其是药物，能够显著影响药酶的活性，并引起自身或其他药物的药代动力学的改变，使得药效增强(中毒)或减弱(无效)，从而导致药物-药物相互作用[15]。中药由于其成分复杂，疗程较长，长期应用有可能对肝脏的药物代谢酶产生影响，影响其他药物的代谢，相互作用可能使毒性增加和产生不良反应。药物间相互作用引发的一系列不良反应，已经引起了医药界的极大关注[16]。因此，研究中草药对细胞色素P450的影响及中草药-中草药或中草药与有效成分并用或组方制剂的药物相互作用及机制，对促进合理配伍用药并最大限度地避免盲目联合用药所导致的不良后果、保证临床用药的有效性和安全性无疑有着重要意义[17]。酚酸类化合物原儿茶酸和原儿茶醛广泛存在于中草药中，然而在体内对细胞色素P450酶表达的影响鲜有报道，了解原儿茶酸与原儿茶醛对P450酶系表达的影响，对于了解原儿茶酸与原儿茶醛与其他临床药物的相互作用，合理指导临床用药具有重要意义。

针对上述情况，本实验主要考察了原儿茶酸与原儿茶醛对细胞色素P450主要亚型mRNA和蛋白表达水平的影响，为阐明原儿茶酸与原儿茶醛在临床上安全合理用药提供更多数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验采用健康的SPF级2月龄C57BL/6小鼠购买于南京大学模式动物研究所，动物合格证号SKXK(苏)2010-0001。雄性，30只，体质量(20±2)g，购买后在实验室适应性饲养一周后用于正式实验，室温22～25 ℃，相对湿度65%，12h明暗交替照明，自由进食、饮水。

1.2 主要试剂及仪器

原儿茶酸(批号：JZ140306，南京景竹 纯度 ≥98%)；原儿茶醛(批号：JZ140510A，南京景竹 纯度≥98%)。cDNA合成试剂盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)购于美国Thermo Fisher公司；荧光定量试剂盒购于罗氏公司(Fast Start Essential DNA Green Master)；PCR引物购于上海生工生物技术有限公司；SDS-PAGE缓冲液、蛋白分子量标准、TEMED、BCA蛋白浓度试剂盒购于碧云天生物技术研究所；ECL发光液购于美国MILLIPORE公司；抗体：兔抗人CYP1A1(H-70)：sc-20772，鼠抗人CYP1A2 (D1tkt5)：sc-53241，兔抗人CYP2A(H-110)：sc-33214，鼠抗人CYP2B(9.14)：sc-73546，鼠抗人CYPOR(F-2)：sc-55477六种一抗购于美国Santa Cruz公司；兔抗人CYP2C(EPR6576)ab137015购于美国Abcam公司；兔抗人CYP2D(PAB19502)购于台湾Abnova公司；兔抗人CYP2E1(BML-CR3271)购于美国Enzo公司。羊抗鼠和羊抗兔HRP二抗LgG(H+L)，购于中国碧云天生物工程公司，其他为分析纯或生化级试剂。荧光定量PCR仪：罗氏Light Cycle 96荧光定量PCR仪。

2 方 法

2.1 动物分组及给药

将C57BL/6小鼠随机分为正常对照组(生理盐水)、原儿茶酸和原儿茶醛(6 mg/kg)给药组，苯巴比妥诱导(80 mg/kg)，每组5只。精密称取药品溶于生理盐水中，给药时间为2周，每24小时灌胃给药1次。正常对照组采用生理盐水按体重给予相当量的溶剂对照液；末次给药后，隔天禁食12 h，二氧化碳窒息法处死小鼠。

2.2 利用荧光定量PCR(RT-PCR)技术考察原儿茶酸和原儿茶醛对小鼠Cyp1a2、Cyp2c37、Cyp2d9基因表达

以TRIzol提取试剂盒说明书提取小鼠肝组织细胞总RNA，紫外分光光度计法测定RNA在A260/A280的比值，纯度A260/A280在1.9～2.0，取总RNA 1 μg，分别加入逆转录试剂至总体积20 μL混合均匀。反转录条件为42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，反应产物-20 ℃保存待用。取上述逆转录产物2 (L加入RT-PCR反应体系：Real SYBR Mixture(with ROX)10 μL，上、下游引物(10 mol/L)各2 μL，cDNA模板各1 μL，加RNase-free水至20 μL。以β-actin作为内参基因，进行PCR扩增的实时定量分析，RT-PCR反应条件：Preincubation：95 ℃ 300 s；3 Step Amplification：95 ℃ 15 s， 61 ℃ 20 s，72 30 s；Melting：65 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s；Cooling：37 ℃ 30 s。实验重复3次。实验数据采用2-ΔΔct法分析得出。RT-PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成(见表1)。

表1 RT-PCR引物

2.3 Western blot法分别测定细胞色素P450酶中主要亚型的表达

随机抽取正常对照组，原儿茶酸，原儿茶醛和苯巴比妥剂量组各3只小鼠，将小鼠肝脏取出称量，用冰冷的0.15 mol/L的KCl冲洗干净，并用吸水纸吸干，称取适量肝组织剪碎，加入50 mmol/L PBS溶液(含KCl 150 mmol/L，蔗糖250 mmol/L，pH 7.5)，制成5%的组织匀浆。9000×g冷冻离心20 min，上清液100000×g冷冻高速离心60 min，沉淀为肝微粒体。将肝微粒体蛋白中加入80 mmol/L PBS，重悬微粒体，手动匀浆器研磨，-80 ℃保存待用。BCA法准确测定蛋白浓度，微粒体蛋白提取方法采用的是差速离心法，无法采用GAPDH和β-actin作为内参。按照Western blot法测定细胞色素P450酶亚型的表达，采用Quantity One软件对免疫荧光条带进行光密度值分析，比较细胞色素P450酶亚型表达的相对变化。

2.4 数据统计学分析

3 实验结果

3.1 小鼠肝脏中细胞色素P450酶主要亚型mRNA表达结果

实验采用RT-PCR法考察了原儿茶酸和原儿茶醛对小鼠肝脏中细胞色素P450酶主要亚型mRNA的表达，如图1中A所示，原儿茶酸对Cyp1a2的mRNA表达有上调作用，说明原儿茶酸能够诱导Cyp1a2的mRNA表达增加，对Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表达无调节作用(图1 B、C所示)。

图1 原儿茶酸对C57BL/6小鼠肝脏中细胞色素P450 酶主要亚型mRNA的表达l.)

如图2中A所示，原儿茶醛对Cyp1a2的mRNA的表达有上调作用，但作用不显著，说明原儿茶醛也可能诱导Cyp1a2的mRNA表达增加，原儿茶醛对Cyp2c37、Cyp2d9的mRNA表达无调节作用(图2B、C所示)。

图2 原儿茶醛对C57BL/6小鼠肝脏中细胞色素P450 酶主要亚型mRNA的表达l.)

图3 原儿茶酸对C57BL/6小鼠肝脏细胞色素P450 酶亚型蛋白表达的影响± S，n=3)

图4 原儿茶醛对C57BL/6小鼠肝脏细胞色素P450 酶亚型蛋白表达的影响± S，n=3)

3.2 细胞色素P450酶主要亚型表达的结果

通过免疫荧光结果结合吸光度值分析发现，如图3中1A2，2E1所示，原儿茶酸对CYP1A2与CYP2E1蛋白的表达有诱导作用，且能诱导CYP1A2与CYP2E1表达显著升高，说明原儿茶酸能够显著诱导CYP1A2与CYP2E1蛋白的表达，对其他蛋白亚型均无诱导或者抑制作用。

如图4中1A2所示，原儿茶醛对1A2蛋白的表达有诱导作用，能使CYP1A2蛋白显著增高，说明原儿茶醛能够显著诱导1A2蛋白的表达，对其他几种蛋白亚型无诱导或抑制作用。

4 讨 论

本实验通过蛋白质印记和定量PCR的手段探究药物对CYP450酶表达水平的影响。mRNA的表达对酶的含量有影响同时对酶的活性有一定的作用，通过mRNA表达结果可以间接了解P450酶的活性。实验结果表明原儿茶酸与原儿茶醛对CYP450酶几种主要亚型的mRNA表达的影响的结果与其对蛋白表达影响的结果基本一致。原儿茶酸与原儿茶醛对CYP1A2蛋白的诱导作用明显，CYP1A2 参与约8.9%临床药物的代谢，有咖啡因、非那西丁、氯氮平、茶碱、他克林、丙米嗪、多环芳烃类致癌物以及咪唑喹啉哌等20多种药物[18]。实验结果提示与该类药物联合使用时应该注意原儿茶酸与原儿茶醛可能导致肝药酶含量增加，从而降低了药物半衰期，应该适当增加给药剂量。

同时，原儿茶酸对CYP2E1蛋白的诱导作用明显，CYP2E1的外源性底物超过70 余种, 大部分具有中性、相对分子质量低(< 100)及亲脂性较高的特点。CYP2E1也参与代谢和糖异生相关的多种内源性物质(酮体和脂肪酸)。CYP2E1酶功能活性可被其底物或非底物的内、外源性化合物调控，如胰岛素和乙醇等。CYP2E1被认为是机体对环境和工业毒物或致癌物敏感程度的重要决定因素[19]。此外，一些卤化麻醉剂包括氟烷，恩氟烷、异氟醚和七氟醚，以及对乙酰氨基酚、氯唑沙宗、三甲双酮等多种药物也主要通过CYP2E1代谢[20]。实验结果提示与该类药物联合使用时应该注意原儿茶酸可能导致肝药酶含量增加，从而降低了药物半衰期，应该适当调整给药剂量。

综上所述，原儿茶酸与原儿茶醛可显著诱导CYP1A2的mRNA和蛋白表达，且原儿茶酸使CYP2E1的蛋白表达量升高。两种化合物对小鼠细胞色素P450酶的表达影响，为后续研究与这两种化合物相关的药物间的相互作用提供了实验数据。由于药物对肝脏代谢酶的影响存在种属差异等问题, 有关研究还待继续深入。

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Effects of Protocatechuic Acid and Protocatechualdehyde on the Expression of Mouse Hepatic Cytochrome P450s

Zhang Xiaoyan, Xu Haimiao, Wang Dujun, Wang Kai, Sui Danjuan, Wei Yuan*

(School of Pharmacy, Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China)

Objective: To investigate the modulatory effects of protocatechuic acid and protocatechualdehyde on the expression of mouse hepatic cytochrome P450s in both mRNA and protein levels. Methods: C57BL/6 mice were randomly divided into control (0.9% saline), protocatechuic acid and protocatechualdehyde (6 mg/kg), and phenobarbital (80 mg/kg) groups. The mice were administered by oral gavage every 48 hours for two weeks. Total mRNA was extracted from liver tissue and reverse transcript for RT-PCR analysis. Liver microsome was also prepared for protein analysis. Results: RT-PCR results showed that theCyp1a2 mRNA was significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde compared with control group (P<0.05). Western blot results showed that CYP1A2 protein was significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde. CYP2E1 protein was also induced by protocatechuic acid. No effects were observed on other P450s. Conclusion: Mouse hepatic CYP1A2 expression could be significantly induced by protocatechuic acid and protocatechualdehyde in mRNA and protein expression. CYP2E1 protein expression was also induced by protocatechuic acid.

potocatechuic acid; protocatechualdehyde; cytochrome P450; expression levels

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.006

2016-03-18

国家自然科学基金项目(81102522，811373480，81202793)；江苏省自然科学基金项目(BK2011473)。

张晓燕(1990—)，女，硕士生，研究方向：中药药理和毒理学研究。E-mail：991066470@qq.com

*通讯作者： 魏渊(1981—)，男，博士，副教授，研究方向：细胞色素P450酶系相关的药物代谢与毒理，药物基因组学。

R963

A

1006-9690(2017)01-0018-04

E-mail：ywei@ujs.edu.cn