滨海白首乌粉发酵试验

王冬梅， 毕可波， 周雪松， 薛友荣， 方 圆， 方希修,4*

(1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2. 中国农业广播电视学校文登分校，山东 文登 264400；3. 江苏滨海县农业科学研究所，江苏 滨海 224500；4.江苏康诺农业科技有限公司，江苏 滨海 224500)

滨海白首乌粉发酵试验

王冬梅1， 毕可波2， 周雪松3， 薛友荣3， 方 圆4， 方希修1,4*

(1. 江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300；2. 中国农业广播电视学校文登分校，山东 文登 264400；3. 江苏滨海县农业科学研究所，江苏 滨海 224500；4.江苏康诺农业科技有限公司，江苏 滨海 224500)

目的：通过制备固态复合微生物制剂与白首乌粉发酵试验，为白首乌粉发酵饮料制备提供科学依据。方法：选用枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸菌等菌最优培养基，各菌种经培养扩大后分别接种到以白首乌粉为原料的发酵培养基。分别测定固态复合微生物制剂的蛋白质、粗脂肪、粗纤维的含量，测定菌体生物量、粗蛋白含量和总蛋白得率；分析发酵白首乌粉的氨基酸变化。结果：固态复合微生物制剂的有效活菌总数为3.09×109g-1，菌体生物量为5.69 g/L，菌体总蛋白得率为0.194 g/L。发酵前白首乌粉氨基酸总量为7.119 g/100g，其中精氨酸与谷氨酸含量比较高，分别达到1.833 g/100g，1.241 g/100g；测得发酵后白首乌粉氨基酸总量为7.369 g/100g，其中精氨酸与谷氨酸含量比较高，分别达到1.591 g/100g，1.245 g/100g。发酵后，精氨酸和胱氨酸减少，其他氨基酸不同程度的增加。结论：制备的固态复合微生物制剂活细菌数量能够保证白首乌粉的发酵，发酵后白首乌粉部分氨基酸含量增加，改善了白首乌粉的品质，为白首乌饮料制备提供依据。

复合微生物制剂；白首乌；饮料

滨海白首乌(耳叶牛皮消)是世界上唯一生长在中国的物种，是中国传统的食、药、美容兼用植物。白首乌味甘、苦，性微温，含有C21甾苷等生物活性物质与多种营养成分，具有补肝肾，强筋骨，益精血，健脾消食，解毒疗疮等功效[1]。白首乌粉是采用新鲜白首乌经过脱皮，烘干粉碎而成。复合微生物制剂由多种微生物复合组成，性质稳定，功能广泛[2-6]。目前微生物发酵技术常采用复合微生物制剂中的一种或几种的混合发酵工艺。本研究以白首乌粉为发酵的主原料，选用枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌、乳酸菌等作为发酵菌种制备固态复合微生物制剂，为生产发酵型白首乌乳饮料提供实验参数。

1 材料与方法

1.1 主要菌种及其来源

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳酸菌(Lactobacillus)等菌种来自于江苏康诺农业科技有限公司与江苏农牧科技职业学院营养研究所。

1.2 主要培养基

枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏4.5 g，蛋白胨9 g，NaCl 5 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃，灭菌20 min。

保加利亚乳杆菌用培养基：牛肉膏4.8 g，蛋白胨9.5 g，乳糖4.9 g，吐温80(Tween 80) 1 g，L-半胱氨酸0.11 g，H2O 1 000 mL，pH 7，121 ℃，灭菌15 min。

乳酸菌用培养基：蛋白胨 9.5 g，牛肉膏10.5 g，酵母膏 5.3 g，K2HPO4·3H2O 2 g，乙酸钠4.5 g，葡萄糖 19 g，吐温80 0.8 g，柠檬酸二铵 2 g，MgSO4·7H2O 0.59 g，MnSO4·4H2O 0.28 g，琼脂 14 g，加蒸馏水1 000 mL，pH 6.2，120 ℃，15 min灭菌备用。

1.3 主要仪器设备

CRDX-28型高压蒸汽灭菌器(上海安亭科学仪器厂)，GNP-9050型隔水式恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司生产)，GZX-DH-2630A型恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂生产)，LDZ5-2型离心机(杭州雷琪实验器材有限公司生产)，ALC-110.4型电子分析天平(深圳市泰立仪器仪表有限公司生产)，THZ-82A台式恒温振荡器(常州国华电器有限公司生产)，B-324全自动凯氏定氮仪(瑞士BUCHI公司生产)，HN-12A红外线消煮炉(上海勇规分析仪器有限公司生产)，SP-7569C紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司生产)。

1.4 固态复合微生物制剂的制备

利用厌氧发酵，按发酵培养基4%的量将乳酸菌二级乳酸菌菌种接种到乳酸菌发酵培养基中，混匀，密封发酵，时间2.5 d。利用好氧发酵，按发酵培养基4%的量将各二级芽孢杆菌菌种分别接种到发酵培养基中，混匀，时间2.5 d。将白首乌脱皮、烘干，粉碎过40目筛，制成白首乌粉，灭菌，冷却，备用。

1.5 白首乌粉发酵饮料的制备

固体发酵条件为：发酵温度30 ℃，控制pH值为7.1，发酵时间为24 h，得到发酵白首乌粉。发酵结束后，将发酵后的产物放入烘箱中，58 ℃烘干粉碎后过40目筛。产品烘干后的水分含量低于12.5%。

1.6 测定指标

1.6.1 发酵后的活菌数

取1 mL发酵培养液，生理盐水稀释后，用血球计数板测定活菌数。固态复合微生物制剂活细菌数计数采用平板计数法，用含2%琼脂的，将含乳酸菌的菌液涂布在MRS平板上，然后覆盖一层琼脂，28 ℃恒温箱中培养48 h，计数[7-9]。

1.6.2 菌体生物量测定

取发酵液，4 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤3次，收集菌体，冷冻干燥，称重。

1.6.3 菌体粗蛋白质(CP)含量测定

菌体粗蛋白质含量测定采用国标GB 50095—2010。

1.6.4 总蛋白得率计算[10]

菌体总蛋白得率(g/L)=菌体生物量(g/L)×菌体CP含量(%)。

1.7 固态复合微生物制剂营养成分分析

粗蛋白：采用凯氏半微量定氮法，KJELTEC 8400全自动定氮仪(瑞典FOSS.TECATOR公司生产)测定；粗脂肪：SZF-06A脂肪测定仪(上海洪纪仪器设备有限公司生产)测定；粗纤维：按GB/T 6434—2006方法测定。

1.8 氨基酸含量的测定方法

采用柱前衍生-高效液相色谱法[11-12]。

2 结果与分析

2.1 固态复合微生物制剂中活细菌数含量

通过微生物发酵培养复配制成固态复合微生物制剂，测定其活细菌数量，固态复合微生物制剂有效活菌总数分别为3.09×109g-1，表明菌剂能在活细菌数量方面保证能在动物机体中发挥作用。

2.2 固态复合微生物制剂中各种营养成分的含量

由表1可以看出：固态复合微生物制剂其营养成分均发生了明显变化。固态复合微生物制剂中的各种微生物利用原料营养物质进行发酵，产生了蛋白质、酶和氨基酸等营养成分。结果见表1。

表1 固态复合微生物制剂营养成分测定结果 g/L

2.3 氨基酸分析结果

取白首乌粉与发酵后的白首乌粉，利用Agilent 1100高效液相色谱仪分别快速测定了其水解氨基酸含量，测得未发酵白首乌粉氨基酸总量为7.119 g/100 g，其中精氨酸与谷氨酸含量比较高，分别达到1.833 g/100 g，1.241 g/100 g；测得发酵后白首乌粉氨基酸总量为7.369 g/100 g，其中精氨酸与谷氨酸含量比较高，分别达到1.591 g/100 g，1.245 g/100 g。发酵后，精氨酸和胱氨酸减少，其他氨基酸不同程度的增加。结果见表2。

表2 白首乌粉发酵前后氨基酸成分分析结果比较

氨基酸名称发酵前含量(g/100g)发酵后含量(g/100g)含量变化(%)天门冬氨酸0.6740.7095.19谷氨酸1.2411.2450.32丝氨酸0.1620.1670.50组氨酸0.1480.1772.90甘氨酸0.2920.32310.62苏氨酸0.1950.22113.33精氨酸1.8331.591-13.20丙氨酸0.4260.48814.55酪氨酸0.1310.1444.52胱氨酸0.0160.015-6.25缬氨酸0.2800.32817.14蛋氨酸0.0650.07515.38苯丙氨酸0.2640.29712.50异亮氨酸0.2360.27014.41亮氨酸0.3000.35618.67赖氨酸0.2950.34215.93脯氨酸0.5610.62110.70总氨基酸7.1197.3693.51

3 讨 论

复合微生物制剂是由两种或多种微生物按合适比例共同培养，充分发挥群体的联合作用优势，取得最佳应用效果的一种微生物制剂[13]。用于工业发酵的微生物主要包括枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等。其适宜生长温度是30～37℃，适宜pH为7.0～7.2。芽孢杆菌是一类好氧菌，能在一定条件下产生芽孢，具有耐高温，耐酸碱和耐压等特点。枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶[14]。蜡样芽孢杆菌是一种常用的益生菌。蜡状芽孢杆菌通过产生各种酶类抑制、降解、水解其他的病原体，也是表现在生物防治应用上的一种途径。蜡状芽孢杆菌产生的酶类包括溶菌酶[15]、氨基酸转氨酶[16]、酰胺酶[17]、纤溶酶[18]等。蜡样芽孢杆菌进入肠道后，主要消耗肠道内氧气，创造厌氧环境，促进厌氧菌生长，能够调整肠道菌群失调，改善微生态环境，能有效地抑制有害好氧菌，促进有益厌氧菌生长。乳酸菌对胃酸性环境有一定的耐受性，在动物体内可以通过生物拮抗、降低pH值来阻止和抑制致病菌的进入和定植，减少有害物质的产生。

本研究制备的固态复合微生物制剂主要菌种均为通常认为是安全的可直接食用的微生物菌种，包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)、乳酸菌(Lactobacillus)等。研究发现，固态复合微生物制剂的有效活菌总数分别为3.09×109g-1，菌体生物量分别为5.69 g/L，菌体总蛋白得率别为0.194 g/L。测得未发酵白首乌粉氨基酸总量为7.119 g/100 g，其中精氨酸与谷氨酸含量比较高；测得发酵后白首乌粉氨基酸总量为7.369 g/100 g，其中精氨酸与谷氨酸含量比较高。发酵后，精氨酸和胱氨酸减少，其他氨基酸不同程度的增加。制备的固态复合微生物制剂活细菌数量能够保证白首乌粉的发酵，发酵后白首乌粉部分氨基酸含量增加，提高了白首乌粉的品质，为白首乌饮料制备提供了技术依据。

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Fermentation Test of BinhaiCynanchumbungeiPowder

Wang Dongmei1,Bi Kebo2, Zhou Xuesong3, Xue Yourong3, Fang Yuan4, Fang Xixiu1,4 *

(1. Jiangsu Agricultural and Husbandry College , Taizhou 225300, China; 2.Wendeng Branch School of China Agricultural Broadcasting and Television School, Wendeng 264400, China;3. Binhai Institute of Agricultural Science and Technology of Jiangsu, Binhai 224500, China;4. Jiangsu Kangnuo Agricultural Science and Technology Co., Ltd., Binhai 224500, China)

Objective: The production parameters was provided byCynanchumbungeipowder drink by preparation of complex microorganisms and fermentation test ofCynanchumbungeipowder. Method:Bacillussubtilis,Bacilluscereus,Lactobacillusbulgaricus,Lactobacillusand other bacteria optimal medium were selected, each cultured bacteria were inoculated inCynanchumbungeipowder. The protein, crude fat, crude fiber of solid-state complex microbial agents , the amount of biomass, crude protein content and total protein percentage were measured, the fermentationCynanchumbungeipowder amino acid was analyzed. Results: The total effective viable solid-state complex microbial agents was 3.09 × 109g, the amount of the biomass was 5.69 g/L and total bacterial proteins percentage was 0.194 g/L of solid compound microbial agents.Total amino acids of the pre-fermentationCynanchumbungeipowder was 7.119 g/100g, and arginine and glutamic acid content were relatively high, reached 1.833 g/100g, 1.241 g/100g; the total amount of flour amino acid fermentationCynanchumbungeipowder was 7.369 g/100g, and arginine and glutamic acid content were relatively high, reached 1.591 g/100g, 1.245 g/100g. The arginine and cystine content was reduced and other amino acids increased in varying degrees after fermentation. Conclusion: TheCynanchumbungeipowder fermentation can be guaranteed, because sufficient solid compound microbial preparation of live bacteria.Some amino acids was increased inCynanchumbungeipowder after fermentation and the qualityCynanchumbungeipowder is improved. It provided the evidence ofCynanchumbungeipowder beverage preparation.

complex microbial agents;Cynanchumbungei; drink

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.01.007

2016-05-18

江苏省农业科技自主创新项目[CX(14)2139]。

TS26

A

1006-9690(2017)01- 0022-04

*通讯作者： 方希修(1965—)，男，博士，教授，研究方向：分子免疫与分子营养代谢调控。