细胞免疫化学p16/Ki-67双染结合DNA倍体分析预测HSIL的研究*

张金秋，朱 萍，陆敏华，董建峰，印永祥，赵 华

(南京医科大学附属无锡市妇幼保健院病理科，江苏无锡 214002)

论著·临床研究

细胞免疫化学p16/Ki-67双染结合DNA倍体分析预测HSIL的研究*

张金秋，朱 萍，陆敏华，董建峰，印永祥△，赵 华

(南京医科大学附属无锡市妇幼保健院病理科，江苏无锡 214002)

目的 探讨DNA倍体分析联合细胞免疫化学p16/Ki-67双染检测对宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)及宫颈鳞癌(SCC)的诊断价值。方法 随机收集细胞学检查73例，其中有少量DNA倍体异常细胞53例,DNA倍体阴性20例，通过细胞免疫化学双染检测p16/Ki-67结果。以病理结果为金标准，对比分析DNA倍体分析和DNA倍体分析联合p16/Ki-67双染对HSIL+的诊断价值。结果 20例DNA倍体阴性的标本中p16/Ki-67双染结果全部阴性。DNA倍体分析对HSIL+的阳性预测值为34.62%，DNA倍体分析联合p16/Ki-67双染对HSIL+的敏感性为84.62%，特异性为92.31%，阳性预测值为78.57%,阴性预测值为94.74%，明显高于DNA倍体分析对HSIL+的阳性预测值(P<0.05)。结论 p16/Ki-67双染可以明显提高HSIL检出的预测值，DNA倍体分析联合p16/Ki-67双染是预测HSIL+的有效方法，适合在医疗资源缺乏的地区实施。

宫颈上皮内瘤样病变；p16/Ki-67双染；细胞免疫化学；DNA倍体分析

宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤的第二位，病死率居恶性肿瘤的第七位。许多因素导致我国宫颈癌筛查工作的第一阶梯细胞学检查不确定性、不稳定性、不标准性，加上细胞学只具有适度的敏感性，需要其他检测提高宫颈癌筛查有效性。近年来DNA倍体分析用来进行宫颈癌筛查。最近国内外大量研究显示：肿瘤的发生、发展及预后与肿瘤抑制基因p16及增殖细胞核抗原Ki67活性密切相关[1-2]。本文通过细胞免疫化学p16/Ki-67双染、DNA倍体检测和病理活检结果探讨细胞免疫化学p16/Ki-67双染在预测宫颈高级别鳞状上皮内病变(HSIL)中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2015年无锡市妇幼保健院病理科行细胞学DNA倍体检测结果中可见DNA倍体异常细胞且具有活检结果53例，年龄21～68岁，中位年龄40.5岁。同期选择细胞学DNA倍体检测阴性20例，年龄22～60岁，中位年龄40岁。

1.2 DNA倍体检测 所有DNA染色片由南京福怡科技发展有限公司全自动细胞DNA定量分析系统(SPICM-DNA型全自动细胞肿瘤筛查分析系统)进行扫描。每张玻片扫描5 000个以上细胞核，系统根据不同细胞核所具有的不同参数特征进行计数和分类。结果分为：(1)未见DNA倍体异常细胞；(2)少量DNA倍体异常细胞：出现1～2个病变细胞(DI)>2.5的异倍体细胞或5%～10%的细胞1.252.5的异倍体细胞或超过10%的细胞1.25

1.3 病理活检结果判断 按2014年WHO《女性生殖器官肿瘤分类》标准分级，分宫颈炎、宫颈低级别鳞状上皮内病变(LSIL)、HSIL、宫颈鳞癌(SCC)。以HSIL及以上病变称为HSIL +认为组织学阳性。

1.4 细胞学p16/Ki-67双染方法 细胞学p16/Ki-67双染试剂盒购置福州迈新生物技术开发公司。细胞薄片置于95%乙醇中固定30 min，流水冲洗1 min。(1)对标本进行EDTA8.0 95 ℃热修复20 min。(2)滴加过氧化物酶室100 μL，室温孵育10 min。(3)滴加组合p16抗体、Ki-67抗体的一抗100 μL，室温孵育60 min。(4)滴加显色剂AP-RED 100 μL，室温孵育20 min。(5)滴加显色剂DAB 100 μL，室温孵育5 min。(6)苏木素衬染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.5 细胞学p16/Ki-67双染检测结果判断 p16定位在细胞核和细胞质上，呈红色；Ki-67定位在细胞核上，呈黄色；细胞核部分交叉反应呈棕褐色。阳性结果是指染色片中出现一个或一个以上的“双染细胞”。“双染细胞”是指一个染色细胞，其细胞质呈红色同时细胞核呈黄色或棕褐色。阴性结果是指染色片中无“双染细胞”，但可以有或没有“单染细胞”。“单染细胞”一个染色细胞，仅细胞质呈红色而细胞核无黄色或棕褐色着色，或细胞核呈黄色或棕褐色而细胞质无红色显色的状态。

1.6 统计学处理 利用SPSS19.0软件进行统计分析，采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

73例宫颈细胞学DNA倍体分析结果显示，20例宫颈细胞学DNA倍体检测阴性，53例宫颈细胞学DNA倍体检测为可见少量DNA倍体异常细胞，组织活检结果发现宫颈炎16例、LSIL 18例、HSIL 13例、SCC 5例。检测HSIL+的阳性预测值为33.96%。

20例宫颈细胞学DNA倍体检测阴性病例中P16/Ki-67双染检测结果全部阴性，因DNA倍体检测阴性没有做宫颈活检，认为是宫颈正常。53例DNA倍体检测可见少量DNA倍体异常细胞病例中因有1例细胞学重新制片检测时细胞学中无病变细胞故剔除不计在内，52例病例中有14例P16和Ki-67双染阳性，14例P16和Ki-67双染阳性病例中活检结果HSIL+11例，LSIL 3例。

DNA倍体联合p16/Ki-67双染检测对HSIL+的敏感性84.62%，特异性92.31%，阳性预测值78.57%,阴性预测值94.74%。与DNA倍体检测对HSIL+的阳性预测值相比，DNA倍体联合p16/Ki-67双染检测可明显提高HSIL+的阳性预测值(P<0.05)。见表1、图1。

表1 p16/Ki67双染结果与宫颈高级别病变比较

A：p16/Ki-67双染阴性；B：p16/Ki-67双染阳性。

图1 p16/Ki-67双染在宫颈细胞学上的表达

3 讨 论

目前在很多发达国家所沿用的常规细胞学或巴氏检查被证实能有效降低宫颈癌的发病率和病死率。超过99%的宫颈癌与高危型人乳头状病毒(HR-HPV)相关[4]。HPV检测有很高的阴性预测值，HPV阴性的妇女在5～7年内不会发展为宫颈癌，因为有非常可信的证据显示从最初感染HPV到宫颈癌至少需要8年时间[5]。文献报道认为6个月后重复检测细胞学只发现少数HSIL，其中28%的HSIL HPV持续感染最终诊断，认为通过重复检查细胞学或HPV检测在减少阴道镜方面缺乏有效性[6]。需要增加新的检测方法提高宫颈高级别病变检出率。

目前为了对抗宫颈癌及其癌前病变，几种辅助诊断方法已经应用于提高细胞学和组织学诊断的准确度。有癌变趋势或已经癌变的细胞核酸异常增生，核酸改变早于细胞形态改变，定量分析细胞内DNA核酸是否改变和改变多少可以直接判断是否异常。由于遗传不稳定性引起染色体的非整倍性已公认为肿瘤形成的主要事件，通过图像检测DNA倍体可能是肿瘤形式的标记物[7]。

DNA倍体检测认为是用来预测宫颈癌前病变的一线主观诊断的方法。当然DNA非整倍体宫颈上皮异常对于每个病人而言，不足以预测临床预后[8]。DNA倍体分析预测宫颈高级别鳞状上皮内病变的敏感度为78.26%，阳性预测值为33.33%[9]。本研究同样发现DNA倍体分析预测HSIL+的阳性预测值为33.96%。有文献报道常规细胞学检测预测HSIL+的阳性预测值是35.2%，DNA倍体检测的阳性预测值是65.9%[10],结果不一致可能与选择标本、例数多少有关。

细胞学诊断是形态学检测，因形态变化缺少客观的判断标准，造成诊断结果重复性不好。最近研究已证实p16和Ki-67的表达均与HR-HPV感染相关[11-12]。目前p16单染和或Ki-67单染已应用于组织学宫颈鳞状上皮病变辅助诊断中，但需要与组织形态学和染色方式结合鉴别鳞状上皮是病变还是化生、反应性改变或萎缩性改变。以往细胞学上研究大多是p16单染和或Ki-67单染进行评估，结果欠佳。有文献报道，p16过表达提示经HPV E7癌蛋白激活，但p16也表达在非异常的细胞上，p16只可能作为CINⅠ级的预后因子[13]。也有相反的报道，使用p16染色用于裁定女性生殖道下段及肛门标本上可能会更准确预测病变级别，避免不必要的切除治疗[14]。本研究发现，p16不仅仅局限于表达在异常细胞上，也部分表达在正常子宫内膜细胞、柱状细胞和化生细胞中。

最近一个重要的生物标记物观点，报道在宫颈细胞学标本上检测p16/Ki-67双标蛋白表达。p16过表达诱导细胞周期阻滞，Ki-67作为通过HPV转化感染介导细胞周期调控的代替标记物[15]。在一个细胞上p16/Ki-67双阳可以作为通过HPV基因蛋白调控细胞周期的标记物，可能是HPV转化感染的标记物[16]。Solares等[17]报道，对130例最初的阴道镜检查正常的病例随访1年发现，有9例发生宫颈鳞状上皮病变或高级别病变，这9例病例中2/3的病例中最初p16/Ki-67双标阳性。最新文献显示，p16/Ki-67双标在HSIL+的阳性预测值明显高于HPV的阳性预测值[18]。本文的研究数据表明，p16/Ki-67双标检测在DNA倍体阳性标本中敏感性84.62%，特异性92.31%，阳性预测值78.57%，阴性预测值94.74%。 p16/Ki-67双标具有重要的临床意义，p16/Ki-67双阳性可明显提高预测宫颈高级别鳞状上皮内病变，与Donà等[16]的报道相符。当然也存在一定的假阳性率和假阴性率，目前仍然没有一个抗体可以100%预测细胞的恶性潜能[19]。

通过p16/Ki-67双染，阳性记数独立于细胞形态学。P16作为宫颈鳞状上皮病变的早期事件，而Ki-67在宫颈鳞状上皮病变进展中持续存在[20]。尽管目前在重复细胞学制片中存在少数病例中无阳性特征细胞，笔者有理由认为有可重复性的细胞学制片的基础上，在DNA倍体分析的基础上进一步进行p16/Ki-67双染可以减少一过性感染造成的假阳性，可明显提高宫颈高级别鳞状上皮内病变检出的预测值，减少了阴道镜和宫颈活检创伤性检查、不必要的患者心理压力和经济负担，特别在细胞学医师缺乏、医疗资源缺乏的地区实施。细胞免疫化学p16/Ki-67双染有可能成为实现宫颈细胞学精准筛查的有效辅助方法之一。

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Study on immunocytochemistry p16/Ki-67 double staining combined with DNA ploidy analysis for analyzing and predicting cervical high grade squamous intraepithelial lesion*

Zhang Jinqiu,Zhu Ping,Lu Minhua,Dong Jianfeng,Yin Yongxiang△,Zhao Hua

(Department of Pathology,Affiliated Wuxi Municipal Maternal and Child Health Care Hospital,Nanjing Medical University,Wuxi,Nanjing 214002,China)

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic value of DNA ploidy analysis combined with immunocytochemistry p16/ki-67 double staining in cervical high grade squamous intraepithelial neoplasia(HSIL) and cervical squamous cell carcinoma(SCC).Methods A total of 73 cases of cytological tests were randomly collected.Among them,53 cases were small DNA ploidy abnormal cells and 20 cases were DNA ploidy negative.The p16/Ki-67 results were detected by immunocytochemistry double staining.With the pathological results as the golden standard,the diagnostic values of DNA ploidy analysis and DNA ploidy analysis combined with p16/Ki-67 double staining in HSIL + was contrastively analyzed by pathologic results.Results Among 20 samples of DNA ploidy negative,the p16/Ki-67 double staining results all were negative.The positive predictive value of DNA ploidy analysis for HSIL + was 34.62%.The sensitivity of DNA ploidy analysis combined with p16/Ki-67 double staining for HSIL + was 84.62%,and its specificity was 92.31%,the positive predictive value was 78.57% and the negative predictive value was 94.74%,which were significantly higher than those of DNA ploidy analysis(P<0.05).Conclusion p16/Ki-67 double staining can significantly improve the prediction value of HSIL.The DNA ploidy analysis combined with p16/Ki-67 double staining is an effective method for predicting HSIL +,which is suitable for the implementation in the areas with lack of medical resources.

cervical intra epithelial neoplasia；p16/Ki-67 double staining;immunocytochemistry;DNA ploidy analysis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.014

江苏省无锡市卫计委妇幼健康成果技术推广项目(FYTG2016-2)；江苏省无锡市卫生计生科技成果和适宜技术推广项目(T201645)。 作者简介：张金秋(1993-)，本科，技师，主要从事肿瘤病理方面的研究。△

，E-mail:yinyrh@sina.com。

R711.74

A

1671-8348(2017)13-1770-03

2016-11-28

2017-01-16)