超声微泡对碱性成纤维生长因子转染大鼠损伤面神经的修复作用研究*

苏俊波，骆文龙，郝亚宁,王德平

(重庆医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科，重庆 400010)

论著·基础研究

超声微泡对碱性成纤维生长因子转染大鼠损伤面神经的修复作用研究*

苏俊波，骆文龙△，郝亚宁,王德平

(重庆医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科，重庆 400010)

目的 应用超声微泡介导碱性成纤维生长因子(bFGF)基因进行受损面神经(大鼠模型)修复，研究其可行性及有效性。方法 将40只SD大鼠制作面神经损伤模型，并分成4组，每组10只；A组：bFGF+超声+微泡组； B组：bFGF+微泡组；C组：bFGF+超声组；D组：单纯手术组(PBS)。于bFGF基因转染后第1、10、20、28天，观察各组大鼠一般状况，检测损伤面神经传导速度、潜伏期及动作电位波幅。提取损伤处面神经组织后采用RT-PCR检测mRNA的表达，Western blot检测bFGF蛋白表达。结果 转染后第20天，A组大鼠术侧有少量胡须可观察到细微摆动；转染后第28天，A组大鼠一般状况较B、C、D 3组恢复得更好。A组面神经损伤后修复的神经电生理表现优于B、C、D 3组；A组bFGF mRNA和蛋白表达量明显高于B、C、D 3组(P<0.05)。结论 超声微泡介导bFGF有助于面神经损伤的修复。

超声微泡；碱性成纤维生长因子；面神经损伤

面神经是支配面部肌肉运动的神经，面神经损伤后致面瘫，严重影响美观及患者生活质量[1-2]。虽经国内外大量研究，面神经损伤后的修复依然是临床重要的难题。基因治疗能从分子层面纠正疾病的发生发展，是极富前景的治疗研究热点。碱性成纤维生长因子(bFGF)对受损面神经具有保护作用[3]。本研究应用超声辐照微泡作为基因导入方法，将bFGF基因介导转染大鼠面神经损伤的模型，观察bFGF的表达及大鼠模型受损面神经恢复情况，探讨该方法的可行性、有效性，为面神经损伤后修复方法提供一种新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只清洁级SD大鼠(雌雄不限)，由重庆医科大学动物实验中心提供，体质量210～240 g，合格证号：SCXK(渝)2007-0011。

1.2 试剂 脂质微泡由重医附二院超声影像学研究所提供；DFGF菌液由重庆医科大学附属第二医院肝病研究治疗中心提供，兔抗鼠β-actin多克隆抗体、Trizol试剂、羊抗兔IgG、兔抗鼠bFGF多克隆抗体、化学发光试剂等由武汉谷歌生物科技有限公司提供。

1.3 方法。

1.3.1 动物模型制作 体位：仰卧位；麻醉：腹腔内注射5%戊巴比妥30 mg/kg，并局部注射5%利多卡因；操作：在手术显微镜下切开大鼠右侧颞骨骨泡，磨去镫骨肌支面神经骨管约3 mm，蚊式钳钳夹面神经干长约 2 mm，力量为三扣，持续60 s，松开30 s，再钳夹60 s，手术显微镜观察面神经损伤程度为束膜性神经中断，符合 Sunderland 损伤Ⅳ度[7]。

1.3.2 质粒提取 bFGF菌液经大肠杆菌扩增16 h后提取纯化；应用酶切电泳鉴定；浓度1 g/L(紫外分光光度计测定)。

1.3.3 脂质微泡与bFGF基因的结合 在2 mL微泡浓度约为(0.5～1.0) ×108个/ mL的微泡瓶中加入0.5 mL含质粒浓度为 1 g/L 的bFGF基因溶液，摇匀，室温静置30 min(混合液中质粒浓度为0.2 g/L)。

1.3.4 动物分组及给药 将面神经损伤模型大鼠分成4组，每组10只；A组：bFGF+超声+微泡组(经股静脉注入1 mL含0.2 mg bFGF的载基因微泡溶液后用超声转染仪紧贴大鼠面神经受损部位体外照射，功率0.75 W/cm2，频率1 MHz,照射10 s,间隔10 s,共2 min)； B组：bFGF+微泡组(仅经股静脉注入与A组同等剂量载基因微泡，但不用超声辐照)；C组：bFGF+超声组(经股静脉插管注入含0.2 mg bFGF溶液1 mL，并使用同A组参数的超声辐照)；D组：单纯手术组(仅输入1 mL PBS作为对照)。

1.3.5 一般状况观察 于基因转染第1、10、20、28天观察每组大鼠饮食、胡须摆动、鼻尖偏向、眼睑闭合情况。

1.3.6 神经电生理检测 于基因转染第28天，以10%水合氯醛麻醉大鼠并固定，将针灸针刺激电极分别插至神经损伤处外周和中枢端肌肉，记录电极插入面颊肌(面神经支配)约为3～5 mm，电极间距离4～6 mm。以频率60 Hz、波宽1 ms的正方波刺激，刺激电流从0 mA开始，至出现动作电位。采用BL-6420C生物信号采集与处理系统，测定潜伏期、传导速度及动作电位波幅。

1.3.7 标本采集 面神经损伤大鼠模型经基因转染28 d后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉；打开胸腔，升主动脉插管，剪开右心耳；迅速灌注0.9%NaCl至右心耳流出血液完全变清；先快后慢灌注约250 mL 4%多聚甲醛致大鼠四肢僵硬。切取损伤处面神经1 cm×1 cm。

1.3.8 损伤处神经组织中bFGF 基因mRNA转录的检测 引物由武汉谷歌生物科技有限公司合成。提取吻合处神经组织RNA(Trizol试剂)，合成cDNA第一链，并以其为模板，进行PCR扩增(94 ℃，30 s,54 ℃,30 s,72 ℃,40 s,35个循环)。mRNA水平用β-actin作为内标，以扩增倍数=2-△△CT表示基因相对表达量。

1.3.9 损伤处神经组织中bFGF蛋白表达检测 采用Western blot法，按100 mg组织∶1 mL细胞裂解液的比例，4 ℃冰浴匀浆，提取总蛋白。用核酸蛋白定量仪进行蛋白定量。取40 μg蛋白，经12%SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维膜上，用封闭液(5%的脱脂奶粉)室温封闭2 h；加入兔抗鼠GDNF多克隆抗体和兔抗鼠β-actin多克隆抗体(1∶ 200稀释)，37 ℃孵育2 h；PBST洗膜，加入羊抗兔IgG(1∶ 400稀释)，37 ℃孵育2 h；化学发光试剂反应约2 min，发光成像仪呈像并测定条带吸光度值。以目的条带和内参条带吸光度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学处理 用SPSS19.0软件进行统计分析，采用多个样本均数间两两比较的q检验进行统计学检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的一般状况 基因转染后各组大鼠无死亡，切口无感染。转染后第1天，每组大鼠均出现饮食降低，胡须伸直，无摆动，鼻尖偏左；转染后第10天，各组大鼠情况较第1天无好转，组间无明显差别；转染后第20天，B、C、D组一般状况无明显改变，A组大鼠术侧有少量胡须可观察到细微摆动，鼻尖仍偏左；转染后第28天，B、C、D组大鼠术侧胡须较前恢复，但摆动无力，鼻尖稍偏左，右眼不完全闭合，A组大鼠术侧胡须可见有力的节律性摆动，鼻尖居中，右眼可闭合。

2.2 神经电生理检测 A组大鼠神经动作电位波幅，传导速度高于B、C、D组，潜伏期低于B、C、D组(P<0.05)，见表1。

表1 转染后第28天各组大鼠损伤面神经神经电生理检测指标

2.3 各组大鼠损伤处神经组织中bFGF基因 mRNA的转录水平 A组bFGF mRNA表达量明显高于B、C、D组(P<0.05)，见图1。

图1 损伤神经组织中bFGF基因mRNA的转录水平

2.4 各组大鼠损伤处神经组织中bFGF蛋白表达水平 A组bFGF蛋白表达量明显高于B、C、D组(P<0.05)，见图2、3。

图2 损伤神经组织中bFGF蛋白的表达

图3 大鼠损伤处神经组织中bFGF蛋白表达水平

3 讨 论

面神经损伤后的修复依然是临床重要的难题。近年来，随着基因治疗的研究进一步深入，基因治疗的神秘面纱正被逐渐揭开，与传统治疗不同的是，基因治疗通过转基因转染目的基因，使损伤的面神经bFGF恢复到正常水平，能够从基因水平调节神经生长因子水平，从而促进修复[4]，因此具有非常可观的前景。目前转基因的载体主要有病毒载体与非病毒载体。两种类型的载体各有优劣，病毒载体较非病毒转染效率高，但细胞毒性也高、免疫原性较强；而非病毒类载体则反之，虽然比较安全，但效率低[5]。选择一个安全、合理以及高效的转染方式在基因治疗的应用中极为重要。既往研究已经证实超声微泡是一种安全、新型及高效的载体。低频超声可介导细胞基因转染,同时,微泡造影剂可提高超声介导基因转染的最高转染率[6]。当微泡造影剂从静脉注射到人体后，微泡会到达靶细胞周围。此时在靶细胞周围给予适当的超声辐照，靶细胞周围的微泡即会破裂，由该微泡携带的目的基因释放进入细胞[7]。

近年来，靶向超声微泡(球)造影剂因其不仅在疾病诊断，而且能在疾病治疗中起到特殊作用而越来越受到关注[8]。在超声靶向治疗中，微泡造影剂有助于定点治疗，且微泡本身能与其他治疗方法相结合等诸多优势，其热效应、空化效应及辐射力等有助于药物在靶向组织中的沉积，从而为起到治疗作用[9]。 低强度超声本身也可以促进神经损伤的修复[10]。

既往研究表明，bFGF复合降解膜能够提高面神经离断伤延期修复神经再生。骆文龙等[11]研究显示bFGF对面神经元保护作用的机制可能是其使受损面神经元Bax及Caspase-3蛋白表达减少,Bcl-2蛋白表达增多,从而使面神经元凋亡发生减少。bFGF可以不经由雪旺细胞或血管生成机制而直接影响轴突，促进受损面神经再生[12]。但是，由于bFGF半衰期短及快速的扩散，采用传统给药方式通常无明显效果[13]。目前研究较多的是通过控制缓释[14]和导管复合物[15-18]等方法来实现bFGF对神经修复的作用。

通过文献查阅及既往研究积累，本研究应用超声微泡作为基因载体，以bFGF作为转染基因，获得了较好的实验效果。从结果可以得出，A组大鼠的一般状况恢复较其余3组好，术侧胡须摆动、鼻尖位置及右眼闭合情况均优于其余3组。而从神经电生理方面，A组大鼠的诱发电位波幅、面神经传导速度以及潜伏期也明显优于其他3组，A组大鼠面神经损伤处bFGF蛋白及mRNA的表达量也显著高于B、C、D 3组。本研究结果充分说明超声微泡造影剂能有效地与目的基因相结合，在适当强度和频率的超声作用下，能有效将目的基因转染靶组织，为修复受损面神经提供安全高效的途径；同时，本研究证实bFGF够促进大鼠面神经损伤的修复，为今后面神经损伤的基因治疗提供新的思路。

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Repair effect of ultrasound microbubble on injuried facial nerve by bFGF transfection in rat*

Su Junbo,Luo Wenlong△,Hao Yaning,Wang Deping

(Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China)

[Abstract] Objective To apply the ultrasound microbubble to mediate basic fibroblast growth factor(bFGF) for conducting the injuried facial nerve(rat model) repair and to investigate its feasibility and efficiency.Methods After establishing the models of facial nerve injury,40 SD rats were divided into 4 groups,10 cases in each group:group A,bFGF +ultrasound+microbubble(bFGF +MB/US),group B,bFGF and microbuble(bFGF+MB),group C,bFGF and ultrasound(bFGF +US) and group D,simple operation(PBS).The general status of rats on 1,10,20,28 d after bFGF gene transfection was observed.The nerve conduction velocity(NCV),incubation period and amplitude of facial nerve action potential were measured.After taking the facial nerve tissue in injuried site,mRNA expression was detected by RT-PCR.Western blot was used to detect the bFGF protein expression.Results On 20 d after transfection,small swing of a small quantity of beard in the operation site of the group A could be observed;on 28 d after transfection,the general slatws of recavely in rats in the group A was better than that in the group B,C and D.The nerve electrophysiology manifestations after facial nerve repair in the group A were superior to the group B,C and D;the amount of bFGF mRNA and protein pxpression in the group A was significantly higher than that in the group B,C and D.Conclusion Ultrasound microbubble mediated bFGF is conducive to the repair of facial nerve injury.

ultrasound mircobubble;basic fibroblast growth factor;facial nerve injury

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.006

重庆市卫生局自然科学基金重点项目(2012-1-041)；重庆市教委科技项目(KJ1600219)。 作者简介：苏俊波(1977-)，硕士，讲师，主要从事耳鼻喉头颈外科疾病及教育教学研究。△

，E-mail:luowenlong163@163.com。

R745.11

A

1671-8348(2017)13-1747-03

2016-11-22

2017-01-10)