阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制研究

2017-06-05 15:00姚阳周民卢绪章姜玉岑岭张修文杨建和
东南大学学报(医学版) 2017年1期
关键词:阿霉素骨髓瘤多发性

姚阳,周民,卢绪章,姜玉,岑岭,张修文,杨建和

(1.泰州职业技术学院,江苏 泰州 225300;2.常州市第三人民医院,江苏 常州 213000;3.南京医科大学附属常州第二人民医院 江苏 常州 213000)

·论 著·

阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制研究

姚阳1,周民2,卢绪章3,姜玉3,岑岭3,张修文3,杨建和3

(1.泰州职业技术学院,江苏 泰州 225300;2.常州市第三人民医院,江苏 常州 213000;3.南京医科大学附属常州第二人民医院 江苏 常州 213000)

目的:探讨阿霉素增强细胞因子诱导的杀伤性(CIK)细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制。方法:用阿霉素处理骨髓瘤细胞株U266以及患者骨髓瘤细胞,流式细胞仪(FCM)检测细胞表面NKG2D配体(MICA/B和ULBPs)表达的变化及CIK细胞对U266细胞杀伤作用的变化。结果:阿霉素处理后U266细胞表面MICA/B表达明显升高(P=0.002),而ULBPs的表达无明显变化。阿霉素亦能够诱导患者骨髓瘤细胞表面MICA/B的表达增加。CIK细胞对阿霉素处理过的U266细胞杀伤作用明显增加(P=0.01),这种杀伤作用可以被抗NKG2D抗体部分抑制(P=0.03)。结论:化疗药物诱导骨髓瘤细胞表面MICA/B表达的增加,从而增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用。

NKG2D配体;细胞因子诱导的杀伤性细胞;骨髓瘤细胞

细胞因子诱导的杀伤性(cytokine-induced killer,CIK)细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用,并在临床得到广泛的应用[1-2]。增强CIK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤力是CIK细胞治疗的关键。研究发现,CIK细胞表达较高水平的NKG2D受体,它能够识别肿瘤细胞表面相应的NKG2D配体,从而对肿瘤细胞实施杀伤作用[3-5]。NKG2D的配体包括MHC Ⅰ类分子(MICA/B)和ULBPs,它在正常的细胞或者组织不表达,但是在肿瘤细胞或者病毒感染的细胞表面表达增加。放射线、化学药物等因素可以诱导肿瘤细胞表面NKG2D配体的表达,从而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[6-7]。蒽环类化疗药物阿霉素为细胞周期非特异性药物,是临床上治疗多发性骨髓瘤的常用药。我们利用阿霉素诱导骨髓瘤细胞表面NKG2D配体的表达增加,探讨阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

骨髓瘤细胞株U266由上海长征医院血液科侯健教授惠赠,细胞置含10%灭活胎小牛血清(FBS)、100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素的PRMI1640培养液,于5%CO2、37℃条件下培养。阿霉素(浙江海正药业);流式细胞抗体包括抗CD138-FITC抗体购于BD公司,抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗体购于R&D公司。流式细胞仪(FCM)为BD公司产品。

1.2 标本的来源

研究对象为来自常州市第二人民医院血液科初诊为多发性骨髓瘤的13例患者,其中男5例,女8例,中位年龄52岁(30~77岁)。诊断均符合中国多发性骨髓瘤诊治指南(2011)。根据ISS分期,Ⅰ期1例、Ⅱ期8例、Ⅲ4例。

1.3 方法

1.3.1 FCM检测阿霉素骨髓瘤株U266 细胞表面NKG2D配体 取U266细胞1×105(100ml)-1,分别加入抗MICA/B-PE、ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗体4μl,4℃避光孵育30min后用PBS洗两遍,用500ml PBS悬浮后上机检测,每标本记录细胞数为1×104个。在培养液中加入阿霉素(终浓度5μg·ml-1)与U266细胞共培养24h后用FCM分析其表面的NKG2D配体(MICA/B和ULBPs)的变化。利用FlowJO 软件分析U266细胞表面NKG2D配体的表达水平,用平均免疫荧光强度(MFI)表示NKG2D配体的表达水平,MFI值小于10定义为阴性(-)。

1.3.2 FCM检测患者骨髓瘤细胞表面NKG2D配体 利用密度梯度离心法分离骨髓瘤患者骨髓中的单个核细胞,取骨髓单个核细胞1×105(100ml)-1,分别加入抗CD138-FITC抗体和抗MICA/B-PE或ULBP-1-PE、ULBP2-PE和ULBP3-PE抗体各4μl,用FCM分析CD138阳性细胞(骨髓瘤细胞)表面NKG2D配体的表达水平。利用FlowJO 软件进行数据分析。

1.3.3 FCM检测CIK细胞对U266细胞杀伤作用 利用FCM检测效应细胞对靶细胞的杀伤作用[8],靶细胞(U266)预选用0.1mmol·L-1Calcein acetoxymethyl ester (CAM)孵育15min后,标定的靶细胞用PBS洗两次,按照5×105孔-1放入圆底的U型管中,然后按照效∶靶比=10加入CIK细胞,在培养箱里共孵育10h后用PBS洗1次,再用结合缓冲液重新混悬细胞,然后用加入7-AAD抗体在常温中孵育15min后用FCM检测特异性杀伤率。特异性杀伤率=(CT-TE/CT)×100% (CT表示在对照孔中活细胞的所占的比率,TE表示测试管中活细胞所占的比率)。在抗体阻滞实验中CIK细胞与10μg·ml-1抗-NKG2D抗体预先一起孵育30min,然后加入到靶细胞中。

1.4 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行分析,U266细胞表面NKG2D配体水平的变化、CIK细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 阿霉素对骨髓瘤细胞NKG2D配体的影响

阿霉素处理24h后,U266细胞表面的MICA/B表达明显增加,ULBPs(包括ULBP1、2、3)水平无明显变化(表1),提示阿霉素诱导了U266细胞表面MICA/B的表达。

表1 阿霉素对骨髓瘤细胞株U266表面NKG2D配体表达的影响

组 别NKG2D配体表达MICA/BULBP1ULBP2ULBP3阿霉素处理前178±15.62.5±1.35.6±3.63.4±2.1阿霉素处理后286±21.65.6±3.66.3±4.23.1±1.6t值7.0211.4030.2190.854P值0.0020.2330.8370.854

2.2 患者骨髓瘤细胞表面NKG2D配体表达水平

大多数患者骨髓瘤细胞表面表达一定水平的NKG2D配体(表2)。用阿霉素处理其中2例患者骨髓瘤细胞后,其表面NKG2D配体的水平有一定增加(未展示)。

表2 患者骨髓瘤细胞表面NKG2D配体表达水平

患者编号NKG2D配体表达MICA/BULBP1ULBP2ULBP3116752653211102521253----4----576-632-6-18910892867589-2054-8275---9----10----11----12--634-13508---

2.3 CIK细胞对骨髓瘤细胞杀伤活性

当效∶靶比为10∶1时,CIK细胞对U266细胞特异性杀伤为(48.8±4.8)%,阿霉素处理U266细胞后,CIK细胞杀伤作用增加至(65.8±5.5)%,两者差异有统计学意义(P=0.01)(图1A)。我们用抗NKG2D抗体预先处理CIK细胞后其对U266细胞的杀伤作用下降了[(38.2±4.6)%],差异有统计学意义(P=0.03)(图1B)。

3 讨 论

NKG2D配体在正常组织中很少表达,但是在肿瘤细胞表面可以检测到高水平的NKG2D配体[6,9,10-11]。免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤与其表面NKG2D配体的表达水平相关[6,12]。因此,诱导肿瘤细胞表面的NKG2D配体表达可以增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

A.CIK对阿霉素处理前后的U266细胞杀伤作用;

B.抗NKG2D抗体阻断后CIK对U266细胞杀伤作用

图1 CIK细胞对骨髓瘤细胞株U266杀伤作用

本研究结果显示:低浓度的阿霉素处理后骨髓瘤细胞株表面的MICA/B明显增高,用阿霉素处理的两例患者骨髓瘤细胞亦得到类似的结果;CIK细胞对阿霉素处理后U266细胞的杀伤作用明显提高,说明化疗药物可以增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用;用抗NKG2D抗体可以明显阻滞CIK细胞对U266杀伤作用,说明CIK细胞对U266杀伤作用部分是由NKG2D受体与配体相互作用介导的,阿霉素增强CIK细胞抗骨髓瘤细胞可能是通过诱导NKG2D配体表达增加来实现的。

综上所述,低浓度的化疗药物可以增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的杀伤作用,通过刺激骨髓瘤细胞表面NKG2D配体的表达增加而增强CIK细胞对骨髓瘤细胞的识别和杀伤作用。

因此,我们可以通过化疗联合CIK细胞治疗肿瘤,增加CIK细胞的治疗效果,为临床治疗肿瘤提供新的策略。

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Mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells

YAO Yang1,ZHOU Min2,LU Xu-zhang3,JIANG Yu3,CEN Ling3,ZHANG Xiu-wen3,YANG Jian-he3

(1.TaizhouPolytechnicCollege,Taizhou225300,China;2.ChangzhouNo.3People′sHospital,Changzhou213000,China;3.theAffiliatedChangzhouNo.2People′sHospital,NanjingMedicalUniversity,Changzhou213000,China)

Objective: To explore the mechanism of adriamycin enhanced CIK cells cytotoxicity against multiple myeloma cells.Methods: Multiple myeloma cell line U266 and the cells from patients with multiple myeloma were treated with adriamycin,the expression of NKG2D ligands (MICA/B and ULBPs) were analyzed by flow cytometry (FCM).The cytotoxicity of CIK cells against U266 cell was detected by flow cytometry.Results: The expression of MICA/B on multiple myeloma cell line U266 was up-regulated after treated with adriamycin (P=0.002),however expression of ULBPs had no changed.The expression of MICA/B on primary plasma cells was also up-regulated after treated with adrimycin.The cytotoxicity of CIK cell against U266 was significantly increased by treated with adriamycin (P=0.01),and the enhancing cytotoxicity was partly blocked by anti-NKG2D Abs (P=0.03).Conclusion:The cytotoxicity of CIK cells against multiple myeloma an enhance by treated with adriamycin through Up-regulating of MICA/B.

doxorubicin;cytokine-induced killer cells;multiple myeloma cell

2016-05-13

2016-08-22

2014年泰州市科技支撑社会发展计划(指导性)项目(201433);常州市卫生局青年科技项目(QN201203);常州市卫生局重大项目(ZD201311)

姚阳(1969-),男,重庆市人,副教授。E-mail:13961018417@163.com

周民 E-mail:zhoumin@medmail.com

姚阳,周民,卢绪章,等.阿霉素增强CIK细胞抗多发性骨髓瘤细胞的机制研究[J].东南大学学报:医学版,2017,36(1):20-23.

R329.2

A

1671-6264(2017)01-0020-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.006

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