人TRB3过表达载体的构建及检测

李杨，胡斌，关亚萍，徐敏，孟祥军，3

(1.南京医科大学上海一院临床医学院 消化科，上海 200080；2.上海交通大学附属第一人民医院 消化科，上海 200080；3.上海交通大学附属第九人民医院 消化科，上海 200030)

·论 著·

人TRB3过表达载体的构建及检测

李杨1，2，胡斌2，关亚萍2，徐敏1，2，孟祥军2，3

(1.南京医科大学上海一院临床医学院 消化科，上海 200080；2.上海交通大学附属第一人民医院 消化科，上海 200080；3.上海交通大学附属第九人民医院 消化科，上海 200030)

目的：构建TRB3真核表达重组质粒，并用肝癌细胞MHCC-97H检测其表达。方法：从肝癌组织中提取并扩增TRB3基因的编码区，将其克隆到真核表达载体pcdh-CMV-MCS-GFP中，酶切并检定，将克隆成功的质粒转染至MHCC-97H细胞中，用qPCR和Western Blot检测TRB3的表达水平。结果与结论：成功扩增了TRB3的编码区，并克隆至真核表达载体中；转染后72、96h，MHCC-97H细胞的TRB3 mRNA和蛋白表达显著增高；成功构建的TRB3过表达载体可用于后续实验。

TRB3；过表达；肝细胞癌

肝癌是导致人类死亡的第6大恶性肿瘤，据统计，2012年全球有745500人死于肝癌，其中大约半数的病例来自于中国[1]。由于肝癌早期临床症状不明显，发现时常常处于终末期，手术切除难度大，药物化疗往往成为终末期肝癌患者的最佳选择[2]。随着肝癌分子生物学研究的不断深入以及精准医疗的提出，人们发现了许多与肝癌诊疗相关的靶基因，TRB3(Tribbles pseudokinase 3)就是其中之一。TRB3最初发现于果蝇，其含有丝/苏氨酸蛋白激酶样结构，但缺乏ATP的结合位点，故没有激酶活性，也被称为假激酶[3]，其生理功能包括调节葡萄糖和脂类代谢、调节脂肪细胞分化、调控胶原表达、参与细胞应激和凋亡等[4-5]。近期研究发现，TRB3与肝癌的发生密切相关[6]，但其具体机制仍未被完全阐明。本实验拟通过构建真核TRB3表达载体并使其在肝癌细胞MHCC-97H中稳定表达，为进一步研究TRB3对肝癌发生、发展的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌组织和细胞系MHCC-97H为上海交通大学胰腺病重点实验室保存，载体pcdh-CMV-MCS-GFP、大肠杆菌感受态细胞DH5α购自上海吉玛基因公司。DEME培养基、胎牛血清(FBS)购自Sigma公司。DNA限制性内切酶(NotI、NsiI、XhoI和NotI)、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTP、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Fermentas公司。基因测序由上海吉玛基因公司完成。脂质体Lipofectamine 2000购于Invitrogen 公司；SYBR qPCR 试剂盒购于TaKaRa 公司。人TRB3引物F:GCTGCCAACAGTGGATTGA，R:GCTTCTGCCTTTCTCCCTTCT和HGAPDH引物F：ATGAGAAGTATGACAACAGCCT，R：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT均由上海生工生物工程有限公司合成。TRB3多克隆鼠抗购于ABCLONAL公司，GAPDH多克隆鼠抗购于SIGMA公司，山羊抗小鼠HRP标记购于JIR公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因获取和扩增 从人肝癌组织中提取总RNA，并逆转录为cDNA，然后以此为模板通过PCR方法扩增目的基因TRB3。PCR反应完成后利用琼脂糖电泳并切胶回收TRB3基因片段[7]。

1.2.2 真核表达载体的构建 用NotI和NsiI对TRB3基因片段进行酶切，用XhoI和NotI对载体pcdh-CMV-MCS-GFP进行酶切。然后用DNA 凝胶回收试剂盒回收TRB3基因片段和载体pcdh-CMV-MCS-GFP，用T4 DNA 连接双酶切得到TRB3基因片段和线性化的载体。将连接产物转化感受态细胞，培养16h后选取1孔抽提质粒，将抽提好的质粒进行双酶切鉴定并送测序。将测序结果与目的基因序列进行比对，正确无误后，进行大量质粒抽提，得到足够量的重组质粒[7]。

1.2.3 细胞培养与转染 肝癌细胞MHCC-97H用含有10% FBS的DMEM 培养基，于37℃、5%CO2的环境中培养。收集处于对数生长期的细胞，铺于6 孔板中，待细胞密度达到80%～90%时进行转染。细胞分为3组：未处理组(B组，未进行转染)、对照组(NC组，转染空质粒)和实验组(TRB3组，转染重组质粒)，每组2孔。最后，按照脂质体转染试剂盒说明书的操作步骤进行转染，转染4h后更换培养液，继续培养72、96h后进行qPCR或Western Blot检测[8]。

1.2.4 转染后TRB3表达的检测 分别使用qPCR和Western Blot检测转录72、96h后肝癌细胞MHCC-97H的TRB3 mRNA和蛋白表达量[7]。

1.3 统计学处理

所有数据均使用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TRB3基因扩增

用cDNA作为模板进行PCR扩增，进行琼脂糖凝胶电泳检测，出现单一条带，大小与TRB3实际扩增的大小相符(图1A)。将双酶切得到的TRB3片段与线性化的载体用DNA连接酶连接，将载体接入感受态细胞培养，抽提质粒并进行双酶切电泳，可见目的基因片段(图1B)；而后将抽提的质粒送公司测序，测序结果与GenBank中的序列一致，证实TRB3过表达载体构建成功。

A.泳道1、2、3、4为人TRB3 PCR扩增产物(如箭头所示)；B.泳道1为质粒酶切后产物，如箭头所示。M为Fermeatas SM0331标记物

A.Lane 1，2，3 and 4 are PCR amplified products of human TRB3(as the arrow showed)；B.Lane 1 is PCR amplified product after double enzymatic digestion(as the arrow showed).M is Fermeatas SM0331 marker

图1 TRB3目的片段PCR电泳图

Fig 1 Telectrophresis of TRB3 target fragment

2.2 转染细胞株TRB3基因mRNA的相对表达量

TRB3过表达质粒转染肝癌细胞MHCC-97H，4h后更换培养液，继续培养72、96h后对细胞进行qPCR检测。培养72h后，TRB3组的TRB3 mRNA相对表达量高于NC组 (图2A)；培养96h后，TRB3组的TRB3 mRNA相对表达量同样高于NC组(图2B)。

图2 转染后qPCR检测TRB3 mRNA的表达

Fig 2 Expression of TRB3 mRNA by qPCR after transfected

2.3 转染细胞株TRB3蛋白的相对表达量

对转染后的细胞继续培养72、96h，进行Western Blot检测，可见过表达转染组细胞内的TRB3蛋白表达水平均显著增高，说明筛选得到的细胞株为成功转染重组质粒并稳定表达TRB3的肝癌细胞MHCC-97H(图3)。

图3 转染后TRB3蛋白的表达Fig 3 Expression of TRB3 protein by Western Blot after transfect

3 讨 论

多项研究结果已证实，TRB3在包括肝癌、结直肠癌、舌鳞癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞和人类肿瘤组织中高表达[9]。对TRB3调控肿瘤的机制研究主要集中在3条信号通路：第一，TRB3可抑制MAPK的激活，从而抑制Ras/Raf以及下游的ERK(extracellular regulated kinase)，改变细胞内基因表达状态，参与调控细胞代谢[10]；第二，TRB3可抑制AKT磷酸化，通过调节AKT-mTOR通路进而调控肿瘤细胞的凋亡和自噬[11]；第三，TRB3与内质网应激(ERS)信号途径相关，在诱导肿瘤细胞凋亡过程中起着重要作用。其中TRB3与ERS是近年的研究热点。当肿瘤细胞不断生长时，肿瘤周围代谢产物蓄积，诱导ERS产生，从而使内质网折叠和转运蛋白功能下降甚至消失[12]。TRB3作为ERS通路中ATF4-CHOP下游的信号分子，最终介导了细胞的死亡[13]。许多抗肿瘤代谢药物，例如盐霉素即可通过调节TRB3引起细胞凋亡，说明TRB3可作为某些化疗药物的靶点[14]。

为了进一步探讨TRB3在肝癌发生、发展中的作用，深入研究TRB3介导肝癌细胞凋亡的作用机制以及TRB3对肝癌治疗的意义，我们成功地构建了TRB3过表达真核载体，并检测转染细胞后其蛋白和mRNA表达情况，为后续的研究提供了有利工具。

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Construction and identification of human TRB3 gene overexpression vector

LI Yang1，2，HU Bin2，GUAN Ya-ping2，XU min2，MENG Xiang-jun2，3

(1.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiFirstPeople′sHospitalofNanjingMedicalUniversity，Shanghai200080，China；2.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiFirstPeople′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080，China；3.DepartmentofGastroenterology，ShanghaiNinthPeople′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200080，China)

Objective: To construct human TRB3 gene overexpression vector and identify its expression in hepatocellular carcinoma cells MHCC-97H.Methods: TRB3 gene was extracted from liver cancer tissue of human and amplified it by reverse transcription.Then it was cloned into pcdh-CMV-MCS-GFP vector for constructing eukaryotic expression vector.The successful cloned vector was transfected into hepatocellular carcinoma cells MHCC-97H，and TRB3 expression was determined by qPCR and Western blot.Results and Conclusion：The coding region of human TRB3 gene is successfully amplified，and cloned into the vector；the expression of TRB3 mRNA and protein are upregulated in MHCC-97H cells after transfected；TRB3 overexpression vector is successfully constructed，which could be used into the post-study.

TRB3；overexpression；hepatocellular carcinoma

2016-06-18

2016-08-30

国家自然科学基金面上项目(81072007)；江苏省研究生培养创新工程项目(SJLX15_0433)

李杨(1990-)，男，安徽滁州人，在读硕士研究生。 E-mail：ayly0550@163.com

孟祥军 E-mail：xiangjunmeng@aliyun.com

李杨，胡斌，关亚萍，等.人TRB3过表达载体的构建及检测[J].东南大学学报:医学版，2017，36(1)：17-20.

R734.7

A

1671-6264(2017)01-0017-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2017.01.005