桉木APMP制浆废水抽出物提取及其抑藻效应研究

程富江， 刘廷志， 李祥祥， 亓 晖， 钟丽鸣

(天津科技大学 造纸学院；天津市制浆造纸重点实验室，天津 300457)

桉木APMP制浆废水抽出物提取及其抑藻效应研究

CHENG Fujiang

程富江， 刘廷志*， 李祥祥， 亓 晖， 钟丽鸣

(天津科技大学 造纸学院；天津市制浆造纸重点实验室，天津 300457)

采用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚2种有机溶剂对自制桉木碱性过氧化氢机械浆(APMP)制浆废水进行有机物提取，采用GC-MS分析对比了2种溶剂抽出物的组成。结果表明：乙酸乙酯提取的抽提物得率为204 mg/L，甲基叔丁基醚提取得率为132 mg/L，经GC-MS分析表明2种溶剂提取的物质种类分别为44种和49种，主要包含有机酸类、醇类、酯类和酚类物质，其中酸类物质的含量最高，分别为76%和80%左右。将乙酸乙酯抽提物应用于铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的抑藻效应研究，发现不同浓度的化感物质对铜绿微囊藻均具有一定程度的抑制作用，且随浓度增加抑藻效应增强。较低浓度的化感物质对铜绿微囊藻有抑制作用但不显著；高浓度的化感物质对铜绿微囊藻具有显著抑制效应，50、100 mg/L时培养7天抑制率分别达到24.8%和77.2%；藻液在446 nm的吸光值测定结果进一步证明了APMP制浆废水中提取的有机物质具有抑藻效果。

化感物质； 抑制作用； APMP制浆废水； 铜绿微囊藻

水体富营养化对淡水及近岸海水生态系统所产生的众多负面影响是当今水环境所面临的主要问题[1]。严重的富营养化会导致藻类快速爆发，并会对人体及水生生物安全造成很大的危害[2]。安全、高效、简便的抑藻方法成为水环境保护领域的一个研究热点，而化感物质和化感效应的应用为解决该问题提供了一条新的思路，相关研究受到国内外的普遍关注。植物化感作用是植物通过向环境中释放化学物质(化感物质)而对另一种生物产生有害或有益的作用。化感作用中以抑制作用较为普遍， 亦称为化感作用或相生相克作用[3-5]。水生植物种间化感作用因受季节性影响，以及受藻类爆发时藻类毒素对水体及水生生物产生的巨大破坏作用影响，大规模应用具有很大局限性。与水生植物相比，陆生植物生物量大、原料易得，其次生代谢物质更加丰富，有广泛存在于水生植物中的化感物质。有研究表明多种陆生植物对水生藻类具有良好的抑制作用[6-7]。因此，陆生植物在抑藻灭藻方面具有更广阔的应用前景。1994年，美国水生植物管理中心将用量为50 g/m3的大麦秸秆直接投加到富营养化水体中用于藻类抑制，取得了巨大成功[8]。与之类似，在苏格兰一处面积为25 000 m2、蓝藻和硅藻大量爆发的水域应用大麦秸秆抑藻研究时发现，水体中的藻量减少一半，水华现象得到了有效控制[9]。马妍等[10]研究了13种陆生植物对铜绿微囊藻和莱茵衣藻的抑藻作用，结果表明，雪松、枫杨、核桃楸和核桃这4种植物是具有应用前景的陆生抑藻植物材料。另外，与水生植物类似，陆生植物化感物质同样为植物生长过程中产生的次生代谢产物，一般均能在自然条件下降解，不会在生态系统中长期积累，生态安全性好。与直接利用植物体化感效应相比，化感物质提取物不影响水体感官，更易于实施和大规模利用。高等植物化感物质的种类繁多，按照化学结构可分为5类：脂肪族、芳香族、含氧杂环化合物、类萜和含氮化合物，多数化感物质为植物中脂溶性成分，其提取过程复杂，是大规模应用于抑藻灭藻过程中存在的关键性问题。目前，高等植物化感物质多采用直接有机抽提、热水或蒸汽抽出后再进行有机抽提等工艺获得。制取后残渣处理等问题是限制其大规模应用的关键。碱性过氧化氢机械浆(APMP)制浆时首先对原料木片进行热水预浸渍，然后经挤压疏解后进行化学浸渍，再经磨浆制备高得率浆，其中预浸渍和化学浸渍是APMP制浆废水的主要来源。利用有机溶剂从制浆废水中提取有机物，这与植物精油(化感物质)提取技术中的先热水浸提再有机溶剂提取工艺相似[11-13]。因此，从制浆废水中提取有机抽出物作为化感物质是一种很好的尝试。桉树属桃金娘科桉属，是世界著名的三大速生树种之一，广泛用于制浆造纸、人造板、细木工板、家具等领域，且具有培育周期短、木材产量高等优点。研究发现，窿缘桉、尾叶桉等对藻类具有化感作用[14-16]。铜绿微囊藻是我国淡水领域中产生蓝藻水华的主要藻类，其水华爆发率极高，并能产生一种环状七肽的微囊藻毒素，不仅严重影响水质，而且通过食物链传递，还会影响人类的健康，是研究水华藻抑藻的代表性藻种[17]。本研究从桉木APMP制浆废水中提取有机抽出物，并将其应用于铜绿微囊藻的抑制研究，以期达到既降低制浆废水处理负荷又可对生物质进行精炼的目的。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桉木木片，取自山东某大型制浆造纸企业，巴西进口尾叶桉和广西蓝桉按质量比8 ∶2混合木片，进口木片树龄约为6年，广西蓝桉木片树龄约为5～6年。藻种：铜绿微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB-905)，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库。二乙基三胺五乙酸(DTPA)，化学纯；硅烷化试剂(BSTFA)，浓度≥90%；H2O2、Na2SiO3、MgSO4、NaOH、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等，均为国产分析纯试剂。

ZQS1型蒸煮锅，陕西科技大学机械厂；js10型螺旋挤压机，安丘汶瑞机械制造有限公司；VARIAN4000 us型气相色谱-质谱联用仪，美国VARIAN公司。

1.2 桉木APMP制浆废水抽出物的提取

1.2.1 桉木APMP制浆废水的收集 废水：实验室模拟APMP制浆工艺自制废水。具体过程如下：称取一定量桉木木片，按液比1 ∶4(g ∶g，木片与水质量比，下同)加入80 ℃热水，在蒸煮锅中升温至80 ℃后保温40 min，经沥水后采用螺旋挤压机挤压疏解，收集废水；疏解后的原料进行化学预浸渍，液比1 ∶4，溶液配比为H2O23%、Na2SiO32%、二乙基三胺五乙酸(DTPA) 0.5%、MgSO40.1%、NaOH 3%、其余为水，浸渍温度80 ℃，保温40 min，收集废水。合并上述热水浸渍废水和化学预浸渍废水即为桉木APMP制浆废水，冰箱冷藏备用。

1.2.2 废水中抽出物的提取 取100 mL 1.2.1节废水调节pH值至2.0，加入50 mL有机溶剂，振荡萃取5 min，离心并收集有机相；再将水相pH值调节到9.0，重新加入50 mL有机溶剂进行萃取，最后将两部分有机溶剂混合，旋转蒸发浓缩至5 mL左右，转入预先洗净并烘干称质量的小瓶中，用5 mL有机溶剂洗涤蒸馏瓶2次，转入有机相小瓶中，60 ℃挥发有机溶剂12 h，干燥器内干燥12 h得到黏稠胶状物质，称质量并计算得率，冰箱冷冻备用。

1.3 有机溶剂抽出物的成分分析

将所得抽出物进行硅烷化[18]处理，采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行成分分析，参照NIST05标准谱库，分析抽出物中有机物质的种类和相对含量[16]。

1.4 铜绿微囊藻的培养及抑藻研究

铜绿微囊藻采用BG11培养基培养[19]。在250 mL锥形瓶中加入150 mL无菌培养基，接入藻种，接种量为10%，置于恒温(25±1)℃、光照强度为(2 000 Lx)、明暗比为12 h/12 h的恒温培养箱中培养，每天定时摇瓶两次。待细胞生长至对数生长期时用于抑藻研究。取适量乙酸乙酯抽出物，用二甲基亚砜溶解并适当稀释，按照一定浓度添加到对数生长期的藻液中，为避免溶剂的影响，添加到试样中二甲基亚砜的量保持一致并不超过藻液总体积的0.2%。

1.5 测定方法

采用藻细胞密度和藻液吸光度来衡量藻类生长状况，用于评价抑藻效果。

藻细胞密度采用血球计数板计数法进行测定，并绘制藻细胞生长曲线。以藻细胞抑制率表示化感物质对铜绿微囊藻的抑制率，计算公式如下[20]：

I=(1-N/N0)×100%

式中：I—藻细胞抑制率，%；N—处理组藻细胞密度，个/mL；N0—对照组藻细胞密度，个/mL。

藻液吸光度通过测定446 nm处吸光度进行衡量，铜绿微囊藻藻液在446 nm处具有特征吸收峰，用于估算藻密度及溶解叶绿素含量。

2 结果与讨论

2.1 APMP制浆废水中抽出物GC-MS分析

采用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚2种有机溶剂对桉木APMP制浆废水中抽出物进行抽提，其中乙酸乙酯提取的抽提物得率为204 mg/L，甲基叔丁基醚提取的抽提物得率为132 mg/L。Gominho等[21]对葡萄牙赛图加尔地区长树龄桉木研究发现，桉木木材树龄越长，抽出物含量越高；7～8年龄尾叶桉二氯甲烷抽出物总量为0.3%；Coloma等[22]对智利的桉木干材进行生物处理，研究生物处理对抽出物的影响，7天组和21天组的正己烷与乙酸乙酯(体积比8 ∶2)抽出物分别为0.27%和0.30%，且处理时间越长，抽出物含量越高。有研究表明杉木粉中含精油为2.5 mg/g[23]。本研究所用木片为混合桉木木片，由巴西进口尾叶桉木片及广西蓝桉木片混合而成(尾叶桉与蓝桉质量比为8 ∶2)，其中进口木片树龄约为6年，广西蓝桉木片树龄约为5～6年，用于APMP浆生产，因此抽出物应在0.25%～0.30%左右。从APMP制浆过程1.1～1.2吨原料可生产1吨APMP浆，精油以2.5 mg/g计，每吨原料中所含精油约2.5 kg，每吨浆原料中精油约为2.7～3.0 kg，每吨浆废水产量约10～15吨，按抽提得率0.2 kg/t废水计(乙酸乙酯抽提率为204 mg/L)，总抽提率不小于70%，因此采用有机溶剂从APMP制浆废水中提取抽出物有很好的可行性。

通过对2种有机溶剂抽出物进行GC-MS分析，得到的总离子流图如图1所示，乙酸乙酯抽出物中有机物为44种，而甲基叔丁基醚抽提的则为49种，其正匹配度和逆匹配度均在64%～95%之间。

表1给出了2种有机溶剂抽出物主要有机物种类及其GC含量。从表1可以看出，乙酸乙酯抽出物中有机物主要包含有机酸类、胺类、醇类、酯类、酚类，其中有机酸类GC含量最高，约占76%，其次为有机胺类，约占7%，醇和酯的GC含量均为5%左右，另外还有少量酚类。资料显示，有机酸和胺类物质多为植物化感物质主要成分，且有关有机酸和胺类物质对藻类的化感作用已有大量研究。陈国元等[24]研究表明，黄菖蒲中的有机酸组分对铜绿微囊藻的生长有一定的抑制作用。邓继选等[25]研究发现，大麦秸秆粗提物中胺类和酯类含量较高，为大麦秸秆中主要的化感物质，并对铜绿微囊藻有抑制作用。甲基叔丁基醚抽出物中有机物主要包含有机酸类、酯类、醇类、酚类，其中有机酸类约80%，酯类约12%。

图1 2种溶剂抽出物总离子流图

表1 2种溶剂抽出物中有机物种类及其GC含量

从组成成分上看，乙酸乙酯抽出物中GC含量最高的5种物质为2-十一烯酸、 3-(3，4-二羟基苯基)丙酸、乙胺、 3，4-二羟基苯甲酸和邻苯二甲酸二丁酯；甲基叔丁基醚抽出物中GC含量最高的5种物质为邻苯二甲酸二丁酯、 3，4-二羟基苯甲酸、对羟基苯丙酸、2-羟基- 4-甲基戊酸和十六烷酸。通过对比发现2种有机溶剂所提取的有机物化学成分中有28种是相同的，二者具有较好的相似度。

2.2 抽出物对铜绿微囊藻生长的影响

2.2.1 较低浓度抽出物 通过对藻种的驯化和培养，测得铜绿微囊藻的生长曲线，将藻种培养至对数生长期，添加不同浓度的化感物质，研究化感物质对藻类细胞密度的作用效果，图2给出了较低浓度化感物质对铜绿微囊藻生长的影响。

图2 较低浓度化感物质对铜绿微囊藻生长曲线的影响

从图2可以看出，随着培养时间的延长，对照组和实验组藻细胞密度都呈现不断增长趋势。在培养前期，实验组和对照组藻细胞密度增加差异不大，甚至还出现了实验组藻细胞密度超过对照组现象；随着培养时间的延长，抽出物对藻类的抑制作用才逐渐显现出来，10 mg/L时抑藻率最高达到了20%以上。出现这种现象的原因可能是较低浓度化感物质对藻类的抑制作用不显著，尤其是培养前期，藻细胞处于对数生长期，细胞活力高，对化感物质抵抗能力强，甚至部分化感物质还可被藻细胞降解或作为营养物质吸收，表现为对藻类生长的“促进作用”，与文献[26-27]结果一致。培养后期，随着培养时间的延长，藻细胞进入衰老和快速死亡阶段，化感物质对藻类的抑制作用逐渐显现出来，造成藻细胞短时间内快速死亡、分解，从而显现出了较显著的抑藻效率。总之，较低浓度化感物质有一定抑藻效应但不显著。

2.2.2 较高浓度抽出物 将抽出物质量浓度提高到50和 100 mg/L，研究了较高浓度化感物质对铜绿微囊藻的抑制作用，结果如图3所示。由图3可以看出，对照组藻细胞浓度随培养时间呈现上升趋势，表现为正常的生长曲线状态。50 mg/L实验组中藻细胞密度虽然也呈现出逐渐上升趋势，但明显低于对照组，表现出了显著的抑藻效果，抑制率稳定在20%左右，最高可到24.8%，从藻细胞密度增加的速度来看，从第4天开始，藻细胞密度开始明显增加，随后逐渐稳定，但始终比对照组低很多。Nakai等[28]研究发现，在投加大型植物(如狐尾藻、水蕴草、菹草等)浸提液抑制铜绿微囊藻生长时，藻细胞在培养8d后开始恢复生长，抑藻作用减弱，这与本研究50 mg/L的抑藻结果类似，只是时间段略有不同。100 mg/L实验组中，除第1天藻密度略高于对照组外，从第2天开始出现急剧下降。第1天实验组藻密度偏高可能与显微镜计数无法区分藻细胞生存状态有关，部分细胞受到抑制甚至已经死亡但未解体也会被计入藻细胞密度。 从培养状态来看，从第2天开始，藻液颜色开始变浅，由深绿色转变为黄色、淡黄色，且藻细胞出现大量聚集、絮沉现象，镜检也发现大量细胞碎片，说明藻细胞出现了大量死亡和解体现象，抑制率也逐渐上升，第7天达到77.2%。培养后期镜检发现细胞出现了不规整现象，说明可能存在藻细胞的死亡和裂解。有学者研究了芦苇化感物质对铜绿微囊藻细胞膜和亚显微结构的影响，发现化感物质可以使铜绿微囊藻细胞壁脱落，细胞膜破裂，细胞内含物渗出，细胞内片层结构解体，内含物的总量上升，细胞内结构损坏，藻细胞由最初的质壁分离进而细胞壁脱落，最终藻细胞裂解死亡[29-30]。吴湘等[31]研究黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻的生长影响时发现，化感物质质量浓度为50～75 mg/L时，培养4～7d内对藻细胞相对抑制率达50%～95%。聂江力等[17]发现没食子酸对铜绿微囊藻的抑制率总体上呈现随浓度的增加抑制率提高的现象。本研究的结果与之类似，说明从APMP制浆废水中提取的抽出物与传统手段得到的化感物质化感效果相似。

图3 较高浓度的化感物质对铜绿微囊藻生长曲线的影响

2.3 抽出物对铜绿微囊藻藻液吸光度的影响

藻液吸光度不仅与藻细胞密度有关，也与培养液中溶解的色素、叶绿素含量等相关，在藻细胞对数生长期，由于细胞活性强、生长状态良好，由细胞解体释放的有色物质较少，其吸光度与细胞数有线性相关性，可辅助衡量藻类生物量[32]。通过全波长扫描发现铜绿微囊藻藻液在446 nm有较强特征吸收峰，因此在培养过程中对藻液在446 nm处的吸光度变化进行了测定，结果如图4所示。由图4(a)可见，添加5和10 mg/L抽出物的藻液在446 nm处的吸光值随培养时间的变化趋势与对照组相同，都呈上升趋势，其中实验组略低于对照组，但差异不大，表明添加低浓度的化感物质对藻类有抑制作用但不明显，与文献[33]结果一致。当较高浓度(50、100 mg/L)时，从第1天开始实验组446 nm吸光度值明显高于对照组，且100 mg/L组远高于50 mg/L组，第1天吸光度值增加就达到47.8%，单独藻密度增加不可能造成吸光值如此大幅度的增加。而随着培养时间增加，增长趋势逐渐放缓，并从第5天开始逐渐被对照组超越。这可解释为较高浓度的化感物质导致了藻类的大量死亡，藻细胞出现了集中大量解体现象，导致有色物质大量溶出，从而使藻液色度增加。随着培养的继续，100 mg/L实验组吸光度还出现了下降趋势， 这可能是由于随着培养时间增加，溶解出的有色物质逐渐被分解褪色，而细胞增殖带来的色度增加无法抵消褪色幅度，导致了色度下降，与文献[34]结果一致。50 mg/L实验组吸光度值虽然也出现了第1天吸光度激增的现象，但后期增加速度逐渐放缓，最终与对照组比较接近，前期的激增跟有色物质溶出干扰有关，后期随着培养的继续，藻密度的增加和溶解物的共同作用使得吸光度值与对照组逐渐接近。有关色度物质的变化机理等还有待于进一步详细研究。

图4 不同浓度化感物质对铜绿微囊藻吸光度的影响(446 nm)

3 结 论

3.1 采用乙酸乙酯和甲基叔丁基醚2种有机溶剂从桉木APMP制浆废水中提取抽出物，并采用GC-MS对抽出物的成分进行了分析。结果表明：乙酸乙酯提取的抽提物得率为204 mg/L，甲基叔丁基醚提取的抽提物得率为132 mg/L；2种抽出物中有机物种类分别为44种和49种，且均以有机酸类物质为主，GC含量分别为76%和80%左右，还有部分醇类、酯类、酚类等物质。

3.2 将乙酸乙酯抽提物应用于铜绿微囊藻的抑藻效应研究。结果表明：桉木APMP制浆废水中提取的抽提物对铜绿微囊藻的生长抑制作用与抽出物浓度密切相关，较低浓度抽出物有抑藻效果但不显著，对吸光度影响不明显；较高浓度时抑藻效果显著，初期由于藻细胞大量死亡溶出有色物质导致吸光度急剧增加，后期随着有色物质的分解沉降吸光度逐渐降低，100 mg/L抽出物培养7天时对藻细胞密度抑制率最高可达77.2%。

3.3 由抽出物抑藻效应可以看出，从桉木APMP制浆废水中提取的抽出物抑藻效果与从植物原料中直接获得的植物精油(化感物质)效果接近，可被认为是化感物质一个全新来源。从制浆废水中提取化感物质不仅无残渣产生，有利于后续废水无害化处理，同时为化感物质提取提供了很好的来源，符合生物质精炼和清洁生产发展模式。

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Extractives of Organics from Eucalyptus APMP Effluents and Its Inhibition Effect on Growth ofMicrocystisaeruginosa

CHENG Fujiang, LIU Tingzhi, LI Xiangxiang, QI Hui, ZHONG Liming

(Tianjin Key Laboratory of Pulp & Paper; College of Papermaking Science and Technology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China)

Eucalyptus APMP effluents were extractedby ethyl acetate (EA) and methyl tertiary butyl ether (MTBE) and the extractives were anaylyzes by GC-MS. The results showed that the yield of EA extractive was 204 mg/L with 44 kinds of organic compounds, and the yield of MTBE extractive was 132 mg/L with 49 kinds of organic compounds. The extractives were composed by acids, alcohols and esters，in which acids were the main compounds accounting for about 76% (extracted by EA) and 80% (extracted by MTBE), respectively. Inhibition effect of EA extractives on the growth ofMicrocystisaeruginosawas investigated. The results showed that the extractives from APMP effluents inhibited the growth ofM.aeruginosawith different effect in different concentrations. The inhibition effect was not remarkable at low extractive concentrations, and the inhibition effect was significant when the concentrations were over 50 and 100 mg/L, with the inhibition rates of 24.8% and 77.2%, respectively. The inhibition effect would be further investigated through the absorbent under 446 nm.

allelochemicals; inhibition; APMP effluents;Microcystisaeruginosa

10.3969/j.issn.0253-2417.2017.02.007

2016- 06- 07

天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目(14JCZDJC40500);天津市国家级大创项目(201610057039)

程富江(1991— )，男，山东泰安人，硕士生，主要从事生物质材料高附加值利用的研究工作

*通讯作者：刘廷志，研究员，博士生导师，主要从事污水治理及生物质精炼等方面的研究工作；E-mail:liutz@tust.edu.cn。

TQ35; TS79; X524

A

0253-2417(2017)02- 0057- 08

程富江，刘廷志，李祥祥，等.桉木APMP制浆废水抽出物提取及其抑藻效应研究[J].林产化学与工业，2017，37(2)：57-64.