冷冻切片干燥处理对HE染色效果的影响

林兴滔，葛 岩，王慧玲，豆文宪，朱小兰

冷冻切片干燥处理对HE染色效果的影响

林兴滔1，葛 岩1，王慧玲2，豆文宪1，朱小兰1

HE染色；冷冻切片；固定液，干燥

冷冻切片是术中快速提供病理诊断和观察组织细胞有效成分的一种重要的手段，在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，再进行切片染色的快速制片。在制片的过程中，临床快速诊断的组织除了需要防冰晶形成外，笔者在实际工作中注意到不同的固定液及不同的处理方案对冷冻制片HE染色质量同样会带来影响，现分析总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取广东省人民医院病理科2016年5月～6月手术送检的冷冻标本50例，包括正常结肠、肺癌、支气管切缘、乳腺癌、卵巢、子宫肌瘤、甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿。

1.2 仪器 英国Shandon Cryotome PSE自动恒温冷冻切片机，Feather N35一次性刀片，樱花OCT包埋剂，冷热电吹风筒(1 000 W)

1.3 试剂配制 Lillie-Mayer苏木精[1]：烧瓶盛700 mL蒸馏水置于电炉上，加入50 g硫酸铝钾，待完全溶解加入5 g苏木精，加热至80 ℃加入碘酸钠0.5 g，持续均匀搅拌，沸腾3～5 min，放置室温冷却至60 ℃加入丙三醇300 mL，室温过夜，次日加入冰醋酸20 mL。水溶性伊红：10 g水溶性伊红加入溶解了10 g无水氯化钙的1 000 mL蒸馏水中，反复摇匀溶解后使用。

1.4 方法 将样本支持器平稳放置在速冻台上，滴加少许OCT包埋剂让其硬化，然后将规范取材的术中冷冻组织放在其表面，用OCT包埋胶完全包裹，组织变硬后即可切片，6～8 μm厚。(1)比较4种固定液的固定效果：冷冻标本连续切4张，分别于10%中性缓冲福尔马林、冷甲醇、冷丙酮和95%冷乙醇中固定30 s，取出水洗，苏木精染色45 s，水洗，0.5%碳酸锂返蓝，水洗，复染伊红5 s，常规脱水透明封片。(2)继续将冷冻标本连续切片2张，经最佳固定液固定后，用冷热电吹风筒分别进行吹风干燥，常规水洗，染色制片，观察冷热干燥对冷冻切片的影响。

2 结果

2.1 4种固定液固定后冷冻切片HE染色结果比较 10%中性缓冲福尔马林和冷丙酮固定冷冻切片组织细胞形态、结构清晰度欠佳，核膜不清，染色质松散，核质染色对比不明显；冷甲醇固定冷冻切片组织细胞形态结构清晰，细胞及胞核收缩不明显，核质染色对比良好、层次分明。95%冷乙醇固定冷冻切片比较甲醇固定，细胞、胞核收缩较明显，染色质不清晰，伊红着色差，核质染色对比不佳(表1，图1)。

2.2 冷冻切片不同干燥处理后镜下观察 选取冷甲醇作为常规冷冻切片固定液，比较未干燥处理冷冻切片HE染色，热风干燥容易导致组织细胞及胞核收缩，染色质缩聚(图2)。对于4例支气管切缘组织，热风干燥组未发生脱片、冷风干燥组与未干燥组分别有1例和3例出现脱片。热风干燥较未干燥处理软骨组织少脱片，冷风干燥冷冻切片HE染色光镜下染色效果与未干燥相同，同时亦较少发生脱片；对于其余类型组织，3种干燥处理的冷冻切片均未发生脱片。

①A①B①C①D②A②B

图1 4种固定液固定后浸润性乳腺癌冷冻切片HE染色比较：A.10%中性缓冲福尔马林固定的冷冻切片；B.冷丙酮固定的冷冻切片；C.95%冷乙醇固定的冷冻切片；D.冷甲醇固定的冷冻切片 图2 冷冻切片不同干燥处理后HE染色比较：A.热风干燥处理冷冻切片；B.冷风干燥处理冷冻切片

3 讨论

固定的主要目的是保持组织细胞形态特征清晰和稳定，作为临床病理快速诊断的重要环节，冷冻切片需要选择合适的固定液，才能最大限度地缩小其与石蜡切片的差异性[2]。

甲醛固定组织是一个渗透、结合和交联的过程[3]，其产生交联的速度要远远比渗透慢，所以甲醛的固定冷冻切片的时间较长，需要10 min以上，影响冷冻切片快速病理诊断结果的报告。甲醇、乙醇和丙酮均属于常见凝固固定剂，丙酮对细胞核的固定不佳，乙醇虽然可以沉淀核蛋白，但是沉淀后的核蛋白溶于水，光镜下核染色不良。甲醇对组织的渗透性强，收缩力略小于乙醇，冷冻切片HE染色细胞及胞核收缩不明显，染色质清晰，核质对比良好。我们通常先将冷冻切片制片的甲醇固定液置于冷冻切片机中预冷，常温甲醇容易导致组织细胞出现肿胀，固定不佳。

冷冻切片在制片的过程中如果出现脱片情况，往往会影响病理诊断的真实性和报告的及时发出。为防止脱片，我们经常会使用电热吹风筒对固定好的组织切片进行干燥处理，本实验比较干燥和未干燥处理的冷冻切片结果，发现冷风干燥可以有效的减少富含纤维、软骨或坏死的组织冷冻切片的脱片现象。冯家成等[4]曾报道热风干燥虽然同样可以减少冷冻切片脱片，但易导致组织细胞及胞核收缩，染色质缩聚，影响术中快速临床病理诊断。

总之，很多因素影响冷冻切片的制片质量，继而影响术中快速病理诊断结果的报告，选择合适的冷冻切片固定液是一项重要的制片环节。冷甲醇固定液配置简单、方便、固定效果良好，可以作为较理想的选择。病理技术人员在进行冷冻切片制片时，对送检的组织需要有所认识，面对富含纤维组织、软骨或坏死的组织可以选择冷风干燥处理，减少脱片现象，及时提供良好的冷冻切片，以服务于术中快速病理诊断。

[1] 张 威, 骆新兰, 朱小兰, 等. Lillie-Mayer苏木素在冷冻切片快速进行性染色中应用[J]. 临床与实验病理学杂志, 2008,24(1):114-115.

[2] 孙丽萍. 五种不同固定液对冷冻切片染色质量的影响[J]. 实验与检验医学, 2011,29(1):95.

[3] 王伯沄, 李玉松, 黄高昇, 等. 病理学技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2000:67.

[4] 冯家成, 杨 静, 张柏辉, 等. 三种不同固定液和固定方法对脑组织冷冻切片的影响[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(5):593-594.

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林兴滔，男，主管技师。E-mail: lingxingtao@126.com 朱小兰，女，副主任技师，通讯作者。E-mail: zxlllp@163.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.030.html

R 329-33

B

1001-7399(2017)04-0463-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.030

接受日期：2016-12-24