Leica、Dako和Roche的免疫组化自动化染色平台应用体会

陈杰伟，刘 君，卢佳斌，陈克明，朱明书，杨远忠，蔡木炎，肖永波

Leica、Dako和Roche的免疫组化自动化染色平台应用体会

陈杰伟，刘 君，卢佳斌，陈克明，朱明书，杨远忠，蔡木炎，肖永波

免疫组织化学；自动化；质量控制；标准化

从1988年第一台code-on自动免疫组化仪的诞生，历经30年的不断改革创新，免疫组织化学自动化技术已取得很大的进展，免疫组化染色结果的一致性、重复性和可靠性得到很大改善，有效地推进了免疫组化的质量控制和标准化进程[1]。但免疫组化自动化染色系统只是高度模拟手工免疫组化操作的所有步骤，在实际应用过程中总会出现诸多问题，本文现观察Leica Bond、Dako AS Link 48和Roche Ventana XT/Ultra三类免疫组化自动化染色平台在临床标准化建设中的应用，旨在为临床病理实验室选择和应用自动免疫组化仪器推进实验室标准化平台建设提供必要的参考。

1 材料与方法

1.1 标本 选择中山大学肿瘤医院病理科在2015年3月～2016年3月期间需行免疫组化染色鉴别诊断和靶向治疗的相关病例(常见的实体肿瘤如乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、肠癌、肝癌等)所用的抗体作为观察对象，材料包括本院手术、活检标本切片和外院会诊蜡块切片及会诊白片。不同抗体在三类免疫组化自动化染色平台上确定一抗最佳反应浓度(信噪比)所需要的阳性及阴性切片均来源于病理诊断明确并由病理医师一致认为表达较为特异的经规范固定的组织。

1.2 试剂 北京中杉金桥浓缩型一抗，Leica浓缩型一抗，基因浓缩型一抗，英硕力浓缩型一抗，迈新浓缩型一抗，Dako浓缩型一抗和Roche即用型一抗，Leica稀释液，二抗检测系统均为三家公司的配套封闭试剂。

1.3 仪器 Leica Bond System、PT Link、Dako AS Link 48、Roche Ventana XT/Ultra。

1.4 方法 针对不同抗体(根据厂家提供的建议浓度、修复条件、阳性对照组织等信息)找相应的阳性对照组织进行连续切片，经过65 ℃烤片1 h后按三类免疫组化自动化染色平台的SOP操作。同一抗体在三类免疫组化自动化染色平台上的测试结果由病理医师和病理技术质控员共同评估、调整及优化。研究期间坚持每天镜检，质控被列为研究目标的197个常规诊断抗体在三类免疫组化自动化染色平台的染色情况，并做好质量控制记录。

2 结果

2.1 一致性高，有效互补 应用三类免疫组化自动化染色平台的标准化流程进行日常抗体染色，大部分抗体稀释度差异明显(表1)；均能达到满意的染色效果，一致性较高(图1)；少部分抗体如VEGF等在部分机器上染色效果欠佳，具有机器选择性。经过长时间筛选优质的一抗和不断优化染色方案，目前常规诊断抗体的上机率达97.0%(191/197)，Leica、Dako、Roche三类免疫组化自动化染色平台的抗体测试通过率分别为74.6%(147/197)、73.6%(145/197)、73.1%(144/197)。

图1 CD30在三类免疫组化自动化染色平台上经过合格测评后染色定位准确，强度合适，背景干净，与手工一致性较高

表1 同一抗体在三类免疫组化自动化染色平台获得满意的染色效果一抗稀释度各异

-.抗体在机器上染色效果不佳，不通过评估；☆信噪比：信号强度与背景的噪值之比；Roche Ventana XT/Ultra大部分抗体基本可以共用同一浓度；限于篇幅，仅列举15个抗体

2.2 有效降低掉片率 部分外院会诊白片存在玻片黏附质量差，组织固定处理不佳及切片过厚等质量问题。为减少掉片率，实验偏向在Leica Bond上检测，Roche Ventana XT/Ultra检测掉片率偏高，这主要与机器洗片方式和要求高质量的亲水性玻片密切相关。

2.3 有效避免白片 外院会诊白片的玻片多为非亲水性，质量参差不一，检测前建议利用脱脂牛奶浸泡白片30 min，改善玻片亲水性，避免产生假阴性，但效果有待进一步观察总结；对于这类非亲水性玻片可以优先选择在Leica Bond上检测，有效避免白片的出现。

3 讨论

病理技术标准化日益成为国际和国内病理学的发展趋势，随着病理实验室对免疫组化染色效率和可靠性的要求越来越高，免疫组化自动化染色将会成为未来病理实验室的发展趋势[1]，下面对免疫组化自动化染色平台标准化建设应用国际国内主流的三家公司的系统情况，结合试剂和阳性对照进行深入探讨。

Leica Bond System最大特点是开发Covertiles专利技术，创造“湿盒”微环境，试剂侧面滴加，最大限度减少对组织的伤害，试剂使用量最小，同时掉片率也最低，这是我科在进行外院会诊白片检测时优先选择Leica Bond的原因。Leica Bond检测系统采用紧密聚合物技术，定位准确，敏感度高，有效提高一抗稀释度。

Dako AS Link 48(半自动)系统最接近手工操作，最大特点是抗原修复液可以做到脱蜡、水化、修复三合一。其开发的EnVision FLEX+二抗检测系统，可以做到精确的抗原定位，适度的信号强度，高敏感性，干净、清晰的染色背景；正因为其优越的染色效果，这也是科研抗体手工操作首选的检测放大系统。但目前Dako AS Link 48半自动系统苏木精背景染色需要手工进行，自动化程度不及Leica Bond和Roche Ventana XT/Ultra。

Roche Ventana XT/Ultra独有的液体封盖膜技术，防止试剂挥发，同时采用空气涡流技术保证均一地分布试剂，避免“边缘效应”及阶梯效应”；采用喷射式清洗技术做到均匀而彻底地清洗，降低背景染色，这个技术也正是造成染色外院会诊白片掉片率偏高的主要原因；在实际运用Roche的这两个系统进行免疫组化染色时，完成后需要用洗洁精洗片去除油膜。

三类免疫组化自动化染色系统相同的是均开放了一抗，采用系统匹配封闭的二抗检测系统，这是导致每个染色系统一抗稀释度不一致的主要因素，当然，抗原修复效率差异也是因素之一。三家公司在检测系统上都不同程度地配有增强剂，如半抗原、Linker等，所以实际上在测试抗体增加增强剂这一步骤时需注意假阳性的发生。

应用自动化检测平台效果和效率如何，其中一抗的质量起了很大的影响，在选购不同公司的一抗时首先需要考虑到抗体的效价、染色质量、试剂的认证要求等因素，其次送货效率，售后服务也是一个不得不考虑的问题，在实际工作中，因为片量比较大，基本在800～1 100张之间，临床诊断抗体种类繁多，达197种，大部分采购浓缩型一抗，抗体效价有保证，利于染色稳定性的控制；在一些与患者靶向用药方面的抗体主要采购与机器相匹配的RTU抗体，如HER-2、D5F3、C-Met等，高品质的RTU是未来发展的趋势。技术质量控制要求监测所有的试剂需在合适的贮存条件下及有效期内，而且需要进行有效的验证才能用于临床检测[2]。所以有必要定期对抗体，尤其是平时用量较少的抗体进行阳性对照和阴性对照试验，排除抗体失效可能[3]；测试中发现抗体在不同仪器染色结果稍有差异，但通过调整仪器染色程序中抗原修复液pH值、修复温度、一抗孵育时间和温度，是否需要添加Linker等，条件优化后大部分抗体在不同系统染色结果能达到一致性和可重现性良好，但仍然有部分抗体只能选择用其中的一两类平台才能通过测试，经过长时间筛选优质的一抗和不断优化染色方案，三类免疫组化自动化染色平台抗体测试通过率基本在74%左右；三类染色平台具有一定的互补性，目前常规诊断抗体的上机率可达97.0%(191/197)；这三类平台基本上可以互补地解决临床病理实验室免疫组化标准化染色过程中遇到的各种问题，可以有效地提高免疫组化染色的质量控制水平和加快临床病理实验室规范化及标准化建设。

在应用免疫组化自动化染色平台的前提是，实验室需要建立适当的阳性对照体系，这是免疫组化染色规范化和标准化的关键因素[4]，也是免疫组化自动化染色平台高效运行的必备条件。而实验室操作人员需要和工程师一起严格做好自动化检测仪器的日常维护，即是免疫组化自动化平台高效运行必需条件。

在免疫组化高度自动化的实验室，病理技术员不应满足于只会简单的机器操作，更应该不断提高专业知识，定期参与熟练能力水平测试[1]，为机器设定最佳染色程序，确保对整个染色流程及机器严格精确把控，为临床诊断提供高质量的免疫组化染色片，同时，实验室应定期参与室间质控，这也是促使免疫组化染色标准化和规范化的有效途径。

综上所述，免疫组化自动化染色系统对组化实验室构建染色流程规范化和标准化的过程起了至关重要的作用，建立自动化、标准化免疫组化染色平台需要病理技术人员提高专业知识，从检测系统和试剂选购与验证，阳性对照设置与应用，室间质控参与等方面做好把关。

[1] 石善溶, 顾 江, 吴秉铨. 抗原修复技术-免疫组织化学发展史上的里程碑[M]. 北京: 北京大学医学出版社, 2014:315.

[2] Bancroft J D, Gamble M. 组织学技术的理论与实践[M]. 6版. 周小鸽, 刘 勇, 主译. 北京: 北京大学医学出版社, 2010:409-423.

[3] 周建云, 何 松, 刘玉山, 等. 全自动免疫组化染色仪染色失败的常见原因及改进措施[J]. 临床与实验病理学杂志, 2013,29(3):345-346.

[4] Torlakovic E E, Nielsen S, Francis G,etal. Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international Ad Hoc expert committee[J]. Appl Immunohistochem Mol Morphol, 2015,23(1):1-18.

2015中大青年项目(520101210104)

中山大学肿瘤医院病理科，广州 510060

陈杰伟，男，硕士，主管技师。E-mail: chenjiew@sysucc.org.cn 肖永波，男，主管技师，通讯作者。E-mail: xiaoyb@sysucc.org.cn

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.031.html

R 446

B

1001-7399(2017)04-0465-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.031

接受日期：2016-12-27