不同pH值甲醛固定液对肾脏标本特殊染色的影响

朱小兰，骆新兰，张科平，武鸿美，许 洁

不同pH值甲醛固定液对肾脏标本特殊染色的影响

朱小兰，骆新兰，张科平，武鸿美，许 洁

肾脏；甲醛；pH值；特殊染色

特殊染色是肾脏病理诊断不可缺少的依据，而特殊染色制片质量是否稳定直接影响到病理诊断的准确性、及时性。制片质量受多种因素影响，其中最关键的是肾脏组织光镜标本的固定，因此固定液的选择至关重要。本文将对配制的三种不同pH值的甲醛固定液用于肾脏组织光镜标本的固定情况进行比较，观察肾脏组织切片六胺银、Masson三色、高碘酸-无色品红等特殊染色的染色效果，找到肾脏组织固定效果最好的固定液配制方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 收集广东省人民医院2014年10月～2015年4月肾内科肾脏穿刺送检组织、外院肾脏穿刺送检组织切片共359例，其中男性238例，女性121例，年龄23～76岁，平均49岁。

1.2 仪器与设备 Shandon全自动密闭脱水机、Shandon Histocentre 3包埋机、Shandon MICROM HM340-E切片机、Shandon全自动封片机、10～100 ℃恒温烘干箱、标签打印机。

1.3 固定剂 A组：10%中性缓冲福尔马林；B组：10%酸性缓冲福尔马林；C组：10%碱性缓冲福尔马林。

1.4 固定液配制 10%中性缓冲福尔马林、10%酸性缓冲福尔马林、10%碱性缓冲福尔马林均为混合PBS-福尔马林固定液，pH值分别为7.0、6.0、9.0(取磷酸二氢钠4.0 g与磷酸氢二钠6.5 mg，加水溶解成900 mL溶液，再加40%甲醛100 mL配制而成，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节到pH值为6.0、7.0和9.0的固定液)。

1.5 方法

1.5.1 标本制备 切取标本时，动作一定要轻，切勿挤压，避免人为破坏肾组织结构，且应在短时间内切取标本。将新鲜的肾脏标本沿肾门切开，取皮髓质交界处组织，按照取材大小(1.2 cm×0.5 cm×0.1 cm)切取4块，分别固定在4种预先配制好的固定液中。固定5 h后取出，当天下午5点半用全自动脱水机进行固定、脱水、透明、浸蜡等处理[1-2]。

1.5.2 方法 4组标本分别进行包埋、连续切片(厚1 μm)，依次裱片于3张载玻片上，进行Masson三色、六胺银、高碘酸-无色品红染色。上述三种特殊染色中的试剂配制和操作流程均按文献要求进行[3]。3张组织切片的Masson三色染色、3张组织切片的六胺银染色、3张组织切片的高碘酸-无色品红染色均在相同条件下进行，以保证结果客观、可信。

1.5.3 评定标准 优：组织切片结构完整，颜色鲜艳，均匀一致，肾小球毛细血管、系膜细胞清晰，细胞无收缩；良：细胞相对清晰，有轻度收缩，形态发生一定改变，核着色分明；差：组织结构模糊，普遍有核溶解现象，胞质染色不清晰，色彩黯哑，染色对比度差。

2 结果

2.1 3组固定液对三种特殊染色切片质量效果比较 通过镜下观察发现，10%中性缓冲福尔马林组，Masson三色法显示组织结构清晰，肾小管胞质和红细胞呈鲜红色，免疫复合物呈红色，胶原纤维、肾小球基膜、系膜呈绿色，细胞核呈蓝褐色。六胺银染色显示组织结构清晰：基膜着色深，背景清晰。高碘酸-无色品红染色显示组织结构清晰：基膜着色呈鲜红色，背景清晰；10%酸性缓冲福尔马林、10%碱性缓冲福尔马林2组固定液Masson三色法染色的结果：组织结构不清晰，有核溶解、核固缩现象，胞质染色不清晰，三色对比度差，染色对比度差。10%酸性缓冲福尔马林、10%碱性缓冲福尔马林2组固定液六胺银法、高碘酸-无色品红染色的结果：组织结构发生改变，有核溶解、核固缩现象，基膜着色深，背景较清晰(10%酸性缓冲福尔马林)，背景红染(10%碱性缓冲福尔马林)(表1，图1～3)。

表1 3组固定液对359例肾脏组织三种特殊染色镜下切片质量效果比较

2.2 3组固定液对三种特殊染色切片质量等级比较 10%中性缓冲福尔马林组：组织无明显收缩，平整度好，切片连续完整，染色优良率在95%以上；10%酸性缓冲福尔马林和10%碱性缓冲福尔马林2组固定液：肾组织结构均不清晰，有核溶解、核固缩现象，胞质染色不清晰，三种特殊染色的优良率仅12%～31%(表2)。

3 讨论

3.1 固定液的作用 固定液的选择至关重要，理想的固定液要满足三点[4]：(1)渗透快，尽可能减少细胞自溶性变化；(2)不改变组织细胞原来生活状态时的形态，不产生人工假象和变形；(3)尽可能保持组织细胞内抗原活性，防止抗原弥散和丢失，因为固定液的pH值可直接影响渗透作用、渗透压、染色强度及背景染色。

3.2 中性固定液对肾脏穿刺组织的作用 10%中性缓冲福尔马林固定液可使新鲜组织中的蛋白质沉淀，细胞保存完好不被溶解，组织形态好，固定均匀，收缩少，既最大程度保存了组织结构的完整，有利于切薄片进行特殊染色，并使细胞内不同成分产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区分[5]。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C

图1 A.10%中性缓冲福尔马林固定：肾组织结构清晰，肾小管胞质和红细胞呈鲜红色，胶原纤维、肾小球基膜、系膜、呈绿色，细胞核呈蓝褐色，三色对比清晰；B.10%酸性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，肾小管胞质和红细胞颜色黯哑，核溶解呈空泡状，三色对比不鲜明；C.10%碱性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，肾小管胞质和红细胞颜色深红，核溶解呈空泡状，三色对比差，Masson三色染色 图2 A.10%中性缓冲福尔马林固定：肾组织结构清晰，基膜呈黑色，背景清晰；B.10%酸性缓冲福尔马林固定：肾组织结构欠清晰，基膜呈黑色，核溶解呈空泡状，背景清晰；C.10%碱性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，细胞肿胀，基膜呈黑色，背景均质红染，六胺银染色 图3 A.10%中性缓冲福尔马林固定：肾组织结构清晰，基膜呈鲜红色，背景清晰；B.10%酸性缓冲福尔马林固定：肾组织结构欠清晰，核溶解呈空泡状，基膜呈红色，背景清晰；C.10%碱性缓冲福尔马林固定：肾组织结构不清晰，细胞肿胀，基膜呈红色，核溶解呈空泡状，高碘酸-无色品红染色

表2 3组固定液对359例肾组织三种特殊染色切片质量等级比较[n(%)]

3.3 酸性固定液对肾脏穿刺组织的影响 组织甲醛久存易致氧化产生甲酸而呈酸性，pH值的影响十分明显，在酸性环境下(-NH3)不能与水合甲醛发生反应，同时固定液放置一段时间后可发生重聚作用，而且重聚作用的速度取决于pH值，pH值低时聚合加快，使固定效果急剧下降[6]，肾组织结构发生改变，残缺，细胞变形、变位，溶液呈酸性，影响Masson三色染色中丽春红、亮绿染色，所制出的切片效果很差，难以诊断。

3.4 碱性固定液对肾脏穿刺组织的影响 在pH>8.0的碱性固定液中，肾组织结构发生了改变，残缺，有核溶解现象，抗原物质被破坏，染色定位差，易产生染色背景，影响对肾小管毛细血管壁及系膜细胞的观察。3组固定液中以10%中性缓冲福尔马林对肾脏组织的固定效果最佳(表1、2)。

3.5 固定液的规范使用 手术标本的无可替代性与不可重复性决定了固定液配制的重要性。由于固定液具有较强刺激性、毒性、腐蚀性，易挥发并对人体健康有危害，目前大多数医院都在使用商品化固定液，而甲醛久存则氧化产生甲酸而呈酸性，因此，病理科对临床科室应重点强调固定液的规范化和标准化。首先，要求商品化固定液的生产厂家必须三证(营业执照、生产许可证、卫生许可证)齐全。其次，要定期检查固定液的生产日期、有效期和固定液的pH值。最后，在标本送检方面，病理科应定期抽查临床科室送检标本固定液的有效期和pH值，将抽查结果详细统计并反馈给医务部门和临床科室，对于不符合要求的送检标本，应积极与临床科室沟通，强调标本固定的重要性，确保临床科室按要求将离体标本及时固定，并保证标本完全浸泡在固定液中，达到送检标本的规范化和标准化，降低医疗风险。

[1] 孟 奎, 马恒辉, 石群立, 等. 病理制片质量控制[J]. 临床与实验病理学杂志, 2001,17(5):439-440.

[2] 杨 枫. 影响HE染色细胞形态的因素控讨[J]. 临床与实验病理学杂志, 1999,15(4):361.

[3] 凌启波.实用病理特殊染色和组化技术[M]. 广州: 广东高等教育出版社, 1989:238-241.

[4] 杨美娟. 组织标本固定方法与免疫组织化学染色效果的关系[J]. 解剖科学进展, 2003,9(1):89-90.

[5] 全国卫生专业技术资格考试专家委员会. 病理学技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2013:261-262.

[6] 王伯沄, 李玉松, 黄高昇, 等. 病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社, 2000:67-70.

国家临床重点专科建设项目(S2013010014009)

广东省人民医院/广东省医学科学院病理医学部病理科，广州 510080

朱小兰，女，副主任技师。E-mail：zxlllp@163.com

时间：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.027.html

R 446.8

B

1001-7399(2017)04-0458-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.027

接受日期：2016-12-19