内皮祖细胞携带KAI1/CD82基因对人鼻咽癌细胞裸鼠模型肺转移的影响

汪庚明，周 燕，孙 谦，徐洪波，查从亮，江 浩，项 平，陈振东

内皮祖细胞携带KAI1/CD82基因对人鼻咽癌细胞裸鼠模型肺转移的影响

汪庚明1，周 燕1，孙 谦1，徐洪波1，查从亮2，江 浩1，项 平3，陈振东4

目的 探讨KAI1/CD82基因在鼻咽癌侵袭转移中的作用，分析转染KAI1/CD82基因的内皮祖细胞在鼻咽癌防治中的应用价值。方法 应用过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染血管内皮祖细胞，获得高表达KAI1/CD82基因的稳转细胞(KAI1/CD82-EPCs)；构建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，通过裸鼠尾静脉注入KAI1/CD82-EPCs；观察KAI1/CD82-EPCs对裸鼠腋下移植瘤及其转移灶的影响。结果 EPCs组、空白组和KAI1/CD82-EPCs组成瘤时间(天)分别为14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55，差异无统计学意义(P=0.771)；EPCs组、空白组和KAI1/CD82-EPCs组移植瘤的重量(g)分别为1.388±0.204、1.487±0.223、1.485±0.234，差异无统计学意义(P=0.274)；EPCs组、空白组和KAI1/CD82-EPCs组肺转移灶生成率分别为55%、45%和10%，差异具有统计学意义(P=0.005)，三组肺脏的转移灶数目分别为34.27±5.35、38.44±9.63、17.50±3.54，差异具有统计学意义(P=0.007)；注射KAI1/CD82-EPCs的实验组肺转移灶KAI1/CD82呈阳性，EPCs组和空白组肺转移灶KAI1/CD82呈阴性。结论 转染KAI1/CD82基因的EPCs对鼻咽癌裸鼠模型的肺转移具有抑制作用。

鼻咽肿瘤；转移抑制基因；KAI1/CD82；血管内皮祖细胞

转移是鼻咽癌治疗失败主要原因之一，在精确放疗时代尤为突出。肿瘤细胞基因组是决定鼻咽癌转移习性的根本因素，故探讨转移相关基因在鼻咽癌转移中的作用显得极为重要。内皮祖细胞是一类能够分化为成熟的血管内皮细胞的前体细胞。临床研究显示内皮祖细胞能够定向归巢于肿瘤组织[1]，利用此特性可将内皮祖细胞作为靶向运输至肿瘤组织的基因载体[2]。本实验拟建立荷人鼻咽癌细胞株裸鼠模型，构建高表达KAI1/CD82基因的稳转细胞(KAI1/CD82-EPCs)，鼻咽癌荷瘤小鼠尾静脉注射KAI1/CD82-EPCs，分析KAI1/CD82基因对该模型转移能力的影响；从而推断KAI1/CD82基因在鼻咽癌转移过程中的作用和价值，为临床预测鼻咽癌患者是否发生转移、个体化治疗以及应用肿瘤转移抑制基因进行早期干预治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 CNE-2Z人鼻咽癌细胞株购自上海优选公司；内皮祖细胞在本课题组前期研究中获得，经形态学观察、流式细胞仪表型鉴定及双荧光染色鉴定；BALB/c-nu雌性裸鼠60只，限龄4～6周，购自南京斯科瑞公司；过表达KAI1/CD82基因的慢病毒，购自上海吉满基因公司。

1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基购自上海生工公司，凝聚胺(Polybrene)购自上海博普公司，四甲基乙二胺(TEMED)购自美国Sigma公司，KAI1/CD82抗体购自美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染内皮祖细胞 在进行慢病毒转染前18～24 h，将贴壁的内皮祖细胞以每孔1×105铺到24孔板中，使细胞在慢病毒转染时的数量每孔约2×105。第2天用2 mL含6 μg/mL的Polybrene新鲜培养基替换原培养基，并根据预实验得到最适MOI值(50)作为标准，加入对应的病毒悬液，37 ℃孵育。4 h后加入2 mL新鲜培养基，继续培养24 h，使用新鲜培养基替换原含病毒的培养基。继续培养48 h后在荧光显微镜下观察转染效率，可见荧光表达明显，72 h后显示荧光表达率更高。在转染3天后，使用嘌呤霉素(2.5 μg/μL)进行筛选，在筛选6天后细胞转染阳性率可达90%以上。

1.3.2 过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染内皮祖细胞后行Western blot检测 根据KAI1/CD82基因的分子量配制5%浓缩胶和10%分离胶；将1×电泳缓冲液加入电泳池，取10 μL已煮过的蛋白，向泳道加入。将浓缩胶电压设置为70 V，分离胶电压设置为100 V，电泳，至溴酚蓝达凝胶底边缘处时停止，于凝胶下缘切角处做标记，使用超纯水冲洗，再在常温下用考马斯亮蓝缓慢振荡染色，2 h后用超纯水清洗，再用脱色液浸泡凝胶，更换3～5次脱色液后蛋白条带变清晰。转膜：电泳结束后根据预染Marker的位置，裁取目的蛋白及内参，并放转膜缓冲液中浸泡。使用转膜缓冲液浸泡剪好的硝酸纤维素膜(NC膜)，约10 min，再由阴极到阳极的顺序放纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫，将电泳槽放在冰浴中，开始电泳，设置80 mA的恒流，时间110 min。封闭：取膜，并用5%脱脂牛奶浸润NC膜，并置摇床上缓慢摇晃约1 h。孵育一抗：用TBST稀释KAI1/CD82一抗后将NC膜封闭于塑料袋中，并于37 ℃水浴箱1 h后4 ℃冰箱过夜，次日再置于37 ℃水浴箱中，经40 min孵育，再置摇床摇晃20 min。经4次TBST液洗膜后孵育二抗：按1 ∶3 000的比例用TBST液稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，P膜封闭于塑料袋中，置于水浴箱孵育，37 ℃ 30 min，摇晃30 min。将底物显色剂滴与P膜上，在经曝光、显影、扫描后得所需蛋白质条带。用同样的方法孵育内参抗体并得到所需的蛋白质条带。

1.3.3 构建荷人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型 将裸鼠用随机数字法分成3组(A、B、C)，每组20只，使用0.2 mL的CNE-2Z细胞株腋下注射预养的60只裸鼠。接种后，密切观察裸鼠变化，记录成瘤时间。在裸鼠接种肿瘤后一周，采用裸鼠尾静脉直接注射法给予干预。具体分组如下：A组为EPCs组；B组为空白组；C组为KAI1/CD82-EPCs组。

当裸鼠出现反应迟缓、进食量下降、消瘦等情况后，以颈椎脱臼方式处死。处死裸鼠后，应立即解剖，完整取其腋下移植瘤、肝脏及肺组织，并将移植瘤称重记录。同时将肺及肝组织取出后先放置Bouin液中固定，待2天后观察肺部转移灶已显示为白色，而肝组织未见明显转移灶。显微镜下观察肺组织转移灶的大小，并同时记录数目。将浸泡于Bouin液中的肺组织制成石蜡切片后，经HE染色，显微镜下观察，并对各组裸鼠肺转移结节的数目进行统计学分析。

1.3.4 免疫组化 取KAI1/CD82-EPCs组裸鼠移植瘤肺转移灶，行免疫组化SP法染色。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规4 μm厚连续切片，分别行HE及免疫组化染色。以PBS代替一抗作阴性对照。阳性染色为细胞质和(或)细胞膜被染成棕黄色。采取二次计分法，具体如下：每张切片选择5个高倍视野，首先阳性细胞着色强度由强至弱分别计分，深棕黄色或棕褐色计为3分、棕黄色计为2分、淡黄色计为1分、无着色计为0分；再将阳性细胞百分比计分，采用高倍视野随机计数500个肿瘤细胞中的阳性细胞所占比例，无阳性细胞为0分，≤10%阳性细胞为1分，11%～50%阳性细胞为2分，51%～75%阳性细胞为3分，>75%阳性细胞为4分。以阳性细胞着色强度和阳性细胞百分数得分的乘积作为结果判定标准，其中≤1分为阴性，>1分则为阳性。

2 结果

2.1 转染KAI1/CD82基因的人脐血内皮祖细胞及行Western blot检测

2.1.1 慢病毒转染进人脐血内皮祖细胞后形态学观察 将过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染进人脐血内皮祖细胞后，在荧光显微镜下可见其携带的绿色荧光蛋白的内皮祖细胞(图1)。

图1 转染KAI1/CD82基因的内皮祖细胞

2.1.2 过表达KAI1/CD82基因的慢病毒转染内皮祖细胞后Western blot检测结果 应用Western blot检测内皮祖细胞内KAI1/CD82蛋白含量，同时以β-actin作为内参，经凝胶图象处理系统分析后进行比较，可见KAI1/CD82蛋白在KAI1/CD82-EPCs组中表达最高(图2)。

图2 Western blot法检测内皮祖细胞内KAI1/CD82的表达

2.2 人鼻咽癌裸鼠移植瘤腋下成瘤时间及成瘤重量 裸鼠腋下接种人鼻咽癌CNE-2Z细胞株后均成瘤，成瘤率为100%。A、B、C组成瘤时间(天)分别为14.70±3.81、15.05±3.85、14.20±3.55，三组数据行方差分析，差异无统计学意义(F=0.261，P=0.771)；A、B、C组移植瘤的重量(g)分别为1.388±0.204、1.487±0.223、1.485±0.234，三组间差异无统计学意义(F=1.325，P=0.274，图3)。

2.4 镜下观察

2.4.1 裸鼠腋下移植瘤HE染色 裸鼠腋下移植瘤HE染色切片在镜下显示为肿瘤细胞核大而深染，排列紊乱，核仁清晰，可见病理核分裂象(图4)。

2.4.2 裸鼠肺转移灶HE染色 裸鼠肺转移灶经HE染色，在镜下可见肿瘤细胞核大深染，且排列紊乱，核仁清晰，见病理核分裂象(图5)。

2.4.3 KAI1/CD82-EPCs组、EPCs组和空白组肺转移灶免疫表型 取KAI1/CD82-EPCs组裸鼠移植瘤肺转移灶，行免疫组化染色，结果显示KAI1/CD82呈阳性(图6)。EPCs组和空白组肺转移灶行免疫组化染色，结果显示KAI1/CD82呈阴性。

③④⑤⑥

图3 裸鼠腋下移植瘤 图4 裸鼠腋下移植瘤HE染色 图5 裸鼠肺转移灶HE染色 图6 KAI1/CD82-EPCs组肺转移灶KAI1/CD82呈阳性，SP法

3 讨论

肿瘤的侵袭和转移是临床治疗中的较大阻碍，鼻咽癌治疗失败的患者中绝大多数伴转移，然而目前临床应对鼻咽癌转移的有效方法仍十分匮乏。因此，分析如何降低进而控制转移的发生率是当今探求鼻咽癌疗效提升的关键。

KAI1基因是1995年由Dong等[3]克隆的特异性肿瘤转移抑制基因。由于KAI1编码的产物与CD82完全相同，故将其并称为KAI1/CD82基因。人类KAI1/CD82基因位于染色体11p11.2上，该基因全长约80 kb，KAI1/CD82基因编码蛋白由267氨基酸残基组成[3]，属于跨膜四超蛋白家族成员之一。研究表明，KAI1/CD8基因表达下调或缺失与肿瘤转移相关[4-6]。

内皮祖细胞又称为成血管细胞，参与绝大多数的血管新生。最近也有不少临床研究证实内皮祖细胞在人类恶性肿瘤血管形成中的作用。内皮祖细胞在细胞因子及相关受体的刺激下，向肿瘤组织特异性锚定、进入肿瘤组织并参与肿瘤血管形成，这一特性为定位肿瘤病灶及发现治疗物质的新载体提供了一定的方向。

基于肿瘤的归巢性，作为靶向载体的内皮祖细胞可为肿瘤治疗提供药物。内皮祖细胞能促进血管生成，其作为载体治疗肿瘤，很多质疑也就随之而来：注入内皮祖细胞，它是否会促进肿瘤生长？该作用是否会超越它的治疗作用？Muta等[7]在空白组注射Walker256肿瘤的小鼠，由于内皮祖细胞促进肿瘤血管生产，肿瘤血液供应增加导致肿瘤进展。随后转染IL-12-EPCs注射同样的小鼠模型，由于其分泌的IL-12强烈地激活NK细胞和TC细胞，扼制肿瘤的发展，抵消内皮祖细胞的促进肿瘤作用。因此，研究者认为转染基因的内皮祖细胞可作为一种肿瘤特异性药物传递系统。使用血管内皮祖细胞作为基因治疗的载体将成为肿瘤一种新的疗法。

很多文献报道内皮祖细胞可作为肿瘤的靶向治疗中的生物基因载体[8-11]，并且选用静脉注入的方式，药物可以准确快速地到达肿瘤区。由于血液循环过程损耗量少，局部药物浓度高，从而达到较好地控制肿瘤的效果。

本实验中构建高表达KAI1/CD82-EPCs组，注入鼻咽癌裸鼠尾静脉，观察KAI1/CD82-EPCs组显著影响人鼻咽癌裸鼠移植瘤肺转移灶的生成率，其肺转移率仅为10%，显著低于EPCs组和空白组；KAI1/CD82-EPCs组裸鼠移植瘤肺转移灶免疫组化标记KAI1/CD82呈阳性；在EPCs和空白组中，KAI1/CD82呈阴性。本实验结果显示内皮祖细胞可作为基因的有效载体趋向肿瘤区，并发挥抑制肿瘤转移的重要作用，携带KAI1/CD82基因的EPCs有望成为鼻咽癌治疗的新方法。

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Effect of KAI1/CD82-expressing EPCs on lung metastasis of a xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma

WANG Geng-ming1, ZHOU Yan1, SUN Qian1, XU Hong-bo1, ZHA Cong-liang2, JIANG Hao1, XIANG Ping3, CHEN Zhen-dong4

(1DepartmentofRadiotherapy,3CentralLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233000,China;2DepartmentofRadiotherapy,TonglingPeople’sHospital,Tongling244000,China;4DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230601,China)

Purpose To clarify the role of KAI1/CD82 in metastasis of nasopharyngeal carcinom and to evaluate the clinical efficacy of KAI1/CD82-expressing EPCs in the prevention of nasopharyngeal carcinoma. Method Umbilical vein-derived EPCs were infected with KAI1/CD82-expressing lenti-virus to get a KAI1/CD82-overexpressing EPC cell line (KAI1/CD82-EPCs). A xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma was established, and KAI1/CD82-EPCs were injected through the tail vein. The effect of the KAI1/CD82-EPCs on growth and metastasis of the xenograft was observed. Results Time required for tumor formation was 14.70±3.81, 15.05±3.85, 14.20±3.55 days respectively for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPCs groups, with no significant difference among the three groups (P=0.771). Weight of the xenograft was (1.388±0.204) g, (1.487±0.223) g, (1.485±0.234) g respectively for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPCs groups, with no significant difference (P=0.274). Rate of lung metastasis was 55%, 45% and 10% for the EPCs, EPCs-NC, and KAI1/CD82-EPC groups, and the difference was significant (P=0.005). Number of metastatic lesions was 34.27 ± 5.35, 38.44 ± 9.63, 17.50 ± 3.54 for the three groups, and the difference was also significant (P=0.007). Immunohistochemistry indicated positive KAI1/CD82 expression in metastatic lesion of the KAI1/CD82-EPCs group, but no KAI1/CD82 expression in the EPCs group or EPCs-NC group. Conclusion KAI1/CD82-expressing EPCs inhibits lung metastasis of the xenograft mouse model of human nasopharyngeal carcinoma.

nasopharyngeal neoplasm；metastasis suppressor gene； KAI1/CD82； endothelial progenitor cell

时间：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.012.html

安徽省高等学校自然科学研究(KJ2015B091by)、蚌埠医学院院级科研课题(BY0925)

1蚌埠医学院第一附属医院肿瘤放疗科、3中心试验室，蚌埠 233000

2铜陵市人民医院放疗科，铜陵 244000

汪庚明，女，博士，主治医师。E-mail: lansefeidian777@163.com

R 739.62

A

1001-7399(2017)03-0287-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.012

接受日期：2017-01-18

4安徽医科大学第二附属医院肿瘤科，合肥 230601