广西人群EPCR基因3′-非编码区rs9574 C/G位点的多态性

梁燕冰，彭丁伟，黄雨晴，韦叶生，罗维贵，李 军，廖品琥

广西人群EPCR基因3′-非编码区rs9574 C/G位点的多态性

梁燕冰1，彭丁伟2，黄雨晴1，韦叶生1，罗维贵1，李 军1，廖品琥1

目的 探讨广西地区健康人群与不同地区、种族人群的内皮细胞蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor, EPCR)基因rs9574 C/G(4678 C/G)位点多态性分布频率的差异。方法 通过单碱基延伸的PCR技术及DNA测序法检测130例广西正常体检人群EPCR基因3′-非编码区rs9574 C/G基因型及等位基因型频率，并对比分析其与中国北京人、非洲人、日本人和欧洲人的基因型及等位基因型频率分布差异。结果 广西地区健康人群EPCR基因rs9574 C/G位点存在三种基因型，分布频率分别为CC(39.2%)、CG(46.2%)、GG(14.6%)，等位基因频率分别为C(62.3%)、G(37.7%)。rs9574 C/G位点基因型及等位基因型分布频率在男女组间相比差异无统计学意义(P>0.05)。广西人群rs9574 C/G位点基因型分布频率与欧洲人和非洲人相比差异有统计学(P<0.05)，而与日本人、中国北京人相比差异无统计学意义(P>0.05)；等位基因分布频率与非洲人、欧洲人和日本人相比差异有统计学意义(P<0.05)，而与中国北京人相比，差异无统计学意义(P>0.05)。结论 广西地区人群EPCR基因3′-非编码区rs9574 C/G位点多态性在不同地区、种族人群间的分布频率存在差异。

内皮细胞蛋白C受体；多态性；广西

EPCR作为蛋白C(protein C, PC)、活化蛋白C(activated protein C, APC)的高亲和力受体，并通过与APC结合促进凝血酶-血栓调节蛋白复合物形成，加速纤溶抑制物活化进而抑制补体系统，主要表达于大血管的内皮细胞表面，参与PC的活化，在炎症疾病中发挥相应的作用[1]。近年来随着分子技术和人类基因组研究的不断深入，内皮细胞蛋白C受体(endothelial cell protein C receptor, EPCR)的基因多态性对人类疾病的影响越来越受到学者们的重视。多项研究表明EPCR的基因多态性与白血病[2]、静脉血栓栓塞症[3]等疾病的发展密切相关。本实验通过对比EPCR基因rs9574 C/G位点的等位基因与基因型频率在广西健康人群与不同地区、种族人群之间的分布差异，分析基因遗传的差异性表达，为探讨同一疾病在不同地域、人群中的遗传学规律提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 根据知情同意并自愿参与原则，标本选取广西右江民族医学院附属医院门诊体检人群，所有受试对象均为长期居住本地的人群，临床和实验室检查指标均在正常范围内、无血缘关系的体检者130例，其中男性96例，女性34例，年龄20～79岁。

1.2 方法

1.2.1 标本制备 采用乙二胺四乙酸三钾(EDTA-K3)抗凝采血管收集全部受试对象外周静脉血2 mL，使用离心柱法提取DNA，-70 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计与合成 EPCR基因rs9574 C/G序列来自NCBI Genebank，使用在线Primer 3 软件设计(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)引物，并由上海天昊遗传分析中心合成。rs9574上游引物：5′-ATGGACTCCTTGGGGGCCTATT-3′；下游引物：5′-GTGGGCAGATGTGGGAGAAGAA-3′；扩增片段长度是310 bp；延伸引物：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAATCCAGCCCCTTC TGA-3′。

1.2.3 PCR反应 PCR反应体系(20 μL)包含1× GC-I Buffer(Takara公司)、3.0 mmol/L Mg2+、0.3 mmol/L dNTP、1 U HotStarTaq Polymerase (Qiagen Inc.)、1 μL样本DNA、1 μL多重PCR引物。PCR循环程序：95 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，65 ℃退火 40 s，72 ℃延伸1.5 min，重复11个循环；然后94 ℃变性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，重复24个循环；72 ℃ 延伸2 min，产物4 ℃保存备用。取20 μL PCR产物，加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶纯化后进行SNaPshot多重单碱基延伸反应，取0.5 μL纯化后的延伸产物上ABI3730XL测序仪，测序仪收集的原始数据用GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems Co., Ltd., USA)进行分析(上海天昊公司协助完成)。

1.3 统计学处理 所有数据采用SPSS 17.0软件进行分析，组间基因型及基因频率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCR基因分型 rs9574C/G位点存在基因多态性，其基因测序验证结果详见图1。

2.2 广西地区EPCR基因型及等位基因分布 将广西地区130例正常体检人群EPCR基因rs9574 C/G位点的基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验(表1)，结果显示符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，具有群体代表性。比较rs9574 C/G位点男女组间多态性分布频率，差异无统计学意义(P>0.05)，其中基因型以CG最多见，占46.2%；等位基因以C频率最高，占62.3%(表2)。

图1 EPCR基因 rs9574 C/G位点测序图1、2、3分别表示CC、GG、CG基因型

位点实际例数基因型Hardy-Weinberg理论例数基因型χ2值P值rs9574CCCGGGCCCGGG0.0390.84351601950.46961.06218.469

表2 广西人群EPCR基因rs9574 C/G位点基因型及等位基因频率男女间的分布[n(%)]

表3 不同地区人群EPCR基因rs9574 C/G位点基因型及等位基因频率分布的比较[n(%)]

2.3 各地区人群间基因型及等位基因的比较 对比分析中国广西健康人群与人类基因组计划(Hapmap)公布的中国北京人、非洲人、日本人和欧洲人的基因多态性数据 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)，结果显示广西人群EPCR基因rs9574 C/G位点基因型分布频率与欧洲和非洲人群相比，差异有统计学意义(P<0.05)，而与北京、日本人群相比，差异无统计学意义(P>0.05)；广西人群rs9574 C/G位点等位基因分布频率与非洲、欧洲、日本人群相比，差异有统计学意义(P<0.05)，与中国北京人群相比，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

3 讨论

EPCR蛋白是I型跨膜糖蛋白，可将PC递呈给凝血酶-血栓调节蛋白复合物，提高PC的活化。EPCR主要通过介导APC间接发挥抗炎、抗凝及细胞保护作用[4]，影响着相关疾病的发生、发展。

EPCR基因(PROCR)位于20号染色体，全长约8 kb，含4个外显子和3个内含子。EPCR 基因存在多种变异，与相关疾病的发病风险有关。研究表明，EPCR基因多态性(rs867186 A/G、rs2069940 C/G)与危重患者发生严重脓毒症、脓毒症休克的风险有关[5]。但也有研究认为相同的EPCR基因变异与疾病发生无关[6-7]，甚至作用相反[8]。

广西地处中国南方沿海，为多民族聚居的自治区，由于其独特的地貌、人群及生活环境相对稳定。本组实验结果显示rs9574 C/G位点则以CG基因型(46.2%)及等位基因C(62.3%)频率最高，该位点基因型及等位基因分布的主要形式，与来自不同种族的报道(人类基因组计划)基本相似，但其相对频率的分布有种族差异。rs9574 C/G位点基因型及等位基因型分布频率与欧洲人和非洲人相比，差异有显著性，其中等位基因型分布频率还与日本人不同。作者前期针对不同基因位点与其他地区人群比较的研究，发现广西人群不同基因位点的多态性与人类基因组计划公布的不同地区人群的基因多态性之间存在明显差异[9-10]。基因多态性的差异影响某些疾病，如脓毒症[11]、肿瘤[12]等疾病的易感性与临床表现。有研究显示EPCR基因rs9574可以降低早发性心肌梗死患者和静脉血栓形成的发病风险[13-14]。但对非洲地区加纳重症疟疾患者的一项研究结果表明，rs9574与重症疟疾的易感性无关[15]。

单核苷酸基因多态性作为人群、地域的一种标志，与人类疾病的发生、发展密切相关。不同地区、种族的人群“遗传背景”不尽相同，研究分析不同地域、人群EPCR基因多态性与疾病的关系有一定的意义。本组实验提示中国广西健康人群EPCR基因rs9574 C/G位点多态性与不同地区和种族人群之间的分布存在差异，体现了“基因-蛋白-疾病”的研究思路，不仅为相关疾病易感人群的识别提供重要理论依据，同时在分子生物学层面研究疾病打下了基础。由于本组实验对象集中于特定的地理区域(广西)，实验结果具有一定的地域代表性。基因多态性的研究将更有助于人们对疾病的预防、认识与治疗。由于本实验样本量较少，并受到环境因素及实验因素等影响，这种分布差异仍需大量实验证实，以便更好地为中国广西人群EPCR基因多态性对疾病的影响提供更可靠的结果，保持科学的严谨性。

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Genetic polymorphism of rs9574 C/G of endothelial cell protein C receptor gene in Guangxi population

LIANG Yan-bing1, PENG Ding-wei2, HUANG Yu-qing1, WEI Ye-sheng1, LUO Wei-gui1, LI Jun1, LIAO Pin-hu1

(1CriticalCareMedicine,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China;2DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Purpose To compare the difference of the genotype and allele of endothelial cell protein C receptor (EPCR)gene rs9574 C/G between Guangxi population and other ethnic groups. Methods The rs9574 C/G polymorphisms of EPCR in 130 cases of Guangxi population were detected by PCR and DNA sequencing. The distribution frequency of allele and genotype was compared with the other four ethnic groups (HapMap-CEU, HapMap-HCB, HapMap-JPT, HapMap-YRI), which was published by the human genome project. Results Three genotypes of CC, CT and TT were found in rs9574 C/G with the frequencies of 39.2%, 46.2%, 14.6% respectively. the allele frequencies of C, T were 62.3% and 37.7%. No significant difference was observed in the frequency of genotype and allele between male and female (P>0.05). There were significant differences in the genotype distribution among Guangxi population, HapMap-CEU and HapMap-YRI (P<0.05). Significant differences of allelic frequency were found among Guangxi population, HapMap-CEU, HapMap-JPT and HapMap-YRI. Conclusion The polymorphisms of rs9574C/G in 3′-noncoding region of EPCR gene in Guangxi population were different in different regions and ethnic groups.

endothelial cell protein C receptor; polymorphism; Guangxi

时间：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.004.html

国家自然科学基金(81560321)、2014年广西医学高层次骨干人才“139”计划培养人选项目、广西研究生教育创新计划(YCSZ2015222)、广西高校急重症分子免疫研究重点实验室项目(yy2015ky002)

1右江民族医学院附属医院重症医学科，百色 5330002广西医科大学附属肿瘤医院麻醉科，南宁 530021

梁燕冰，女，硕士研究生。E-mail: liangyanbing520@163.com 廖品琥，男，教授，主任医师，博士生导师，通讯作者。 E-mail: liaopinhu@163.com

R 466.1

A

1001-7399(2017)03-0249-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.004

接受日期：2017-01-18