乳腺癌中RNF2的表达及其临床意义

李 庆，吴正升，沈玉君，冯利杰，沈玉先

·论 著·

乳腺癌中RNF2的表达及其临床意义

李 庆1，吴正升1，沈玉君2，冯利杰2，沈玉先2

目的 观察RNF2在乳腺病变组织及乳腺上皮细胞系中的表达，探讨其表达与乳腺癌临床病理特征的关系。方法 运用免疫组化EnVision两步法检测21例乳腺良性病变组织和112例乳腺癌组织中RNF2蛋白的表达，分析其表达与乳腺癌临床病理特征的关系。应用qRT-PCR法检测2株乳腺正常上皮细胞系和5株乳腺癌细胞系中RNF2基因的表达。结果 乳腺癌组织中RNF2蛋白表达水平与乳腺良性病变组织相比显著升高(P<0.05)，且其表达与乳腺癌肿瘤直径、腋窝淋巴结转移数目、TNM分期显著相关(P均<0.05)；与患者年龄、组织学分级、ER、PR、HER-2表达情况无显著相关(P均>0.05)；乳腺癌细胞系RNF2 mRNA水平亦高于乳腺良性上皮细胞系(P<0.05)。结论 RNF2在乳腺癌组织中高表达，可作为乳腺癌治疗的潜在靶点。

乳腺肿瘤；环指蛋白2；免疫组织化学；qRT-PCR

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，在我国女性癌症发生率和病死率中分别居第1位和第6位[1]；探索乳腺癌进展机制，寻找潜在的治疗靶点，成为广大科研工作者的研究热点。RNF2是多梳蛋白家族(polycomb group proteins, PcGs)的核心成员之一，具有E3连接酶的活性，从而在人类多种肿瘤中发挥重要作用[2]。目前，关于RNF2在乳腺癌中的表达及其意义国内尚未见相关报道。本文着重探讨RNF2在乳腺癌中的表达，并分析其表达与临床病理学特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2003～2004年安徽医科大学第一附属医院病理科存档的112例乳腺癌标本和21例乳腺良性病变(包括乳腺腺病和纤维腺瘤)标本，患者均为女性，且所有患者术前均未行放、化疗等抗肿瘤治疗。依据 WHO(2012)乳腺肿瘤分类标准对各例进行病理学分型、分级和分期[3]。所有组织均以10%中性福尔马林固定，常规脱水浸蜡，石蜡包埋，4 μm厚切片，常规HE染色。

1.2 组织芯片制备 光镜下观察常规HE染色切片，并进行定位、标记，选取病变明显且组织坏死较少的位点，每例供体标本选3个位点；使用TM-1型组织芯片制备仪(辽宁恒泰公司)，取样针内径为1.5 mm，根据HE切片的定位，在相应组织蜡块上找到取样位置，通过取样、点样，每枚蜡块制成11×9点阵；以4 μm厚连续切片，贴附于10%多聚赖氨酸预处理的防脱载玻片上。

1.3 细胞培养 实验所用的乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系HMEC、MCF-10A、BT549、SKBR3、MCF-7、MDA-MB-231、T47D均购自ATCC公司，按照推荐条件培养(采用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2条件下培养)；待细胞融合率达90%时提取RNA。

1.4 免疫组化 兔抗人RNF2多克隆抗体购自Origene公司，稀释度1 ∶500。免疫组化EnVision两步法试剂盒及DAB显色剂试剂盒均购自北京中杉金桥公司。具体操作步骤按试剂盒说明书进行，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。由两名病理医师采用双盲法对染色切片进行全面观察，以细胞质和(或)细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性；每例切片随机选择3个高倍视野(200倍)的阳性细胞进行计数，阳性细胞比例≥10%即为阳性组，其余均为阴性组。

1.5 RNA提取和逆转录 使用Trizol试剂(Ambion公司)按试剂盒说明书从前述7株细胞系中提取总RNA。取1 μg细胞总RNA加入RT酶试剂盒(Takara公司)和灭RNA酶的水，配成20 μL体系，在37 ℃的条件下行RT-PCR 15 min，在85 ℃的条件下维持15 s后终止。

1.6 qRT-PCR 以逆转录得到的cDNA作为模板进行qRT-PCR反应。以GAPDH为内参，反应条件为：预变性95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，合计40个循环，最后延伸60 ℃ 30 s。每组设定3个复孔，重复3次；进行qRT-PCR的引物序列如下。RNF2上游： 5′-GCGAGGCAAGAAACAACAG-3′，下游：5′-CAACAGTGGCGTTACCAGAA-3′；GAPDH上游：5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游：5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′；引物均由上海生工公司合成。

1.7 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。样本率分析应用χ2检验，定量资料比较用Studentt检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RNF2蛋白在乳腺癌组织和乳腺良性病变中的表达 RNF2在乳腺癌组织和乳腺良性病变组织中的表达，主要定位于细胞质和细胞核(图1)。在112例乳腺癌组织中，63例RNF2蛋白阳性，49例阴性；21例乳腺良性病变组织中，6例RNF2为阳性，15例阴性。RNF2蛋白在乳腺癌组织中的表达明显高于乳腺良性病变组织，两者差异有统计学意义(χ2=5.427，P<0.05，表1)。

AB

图1 A.乳腺癌组织中RNF2呈阳性，EnVision两步法；B.乳腺良性病变组织中RNF2呈阴性，EnVision两步法

表1 RNF2在乳腺癌组织和乳腺良性病变组织中的表达

2.2 RNF2蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系 RNF2蛋白表达与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移数目和TNM分期相关(P<0.05)；与患者年龄、组织学分级、ER、PR、HER-2表达情况无关(P>0.05，表2)。

表2 RNF2表达与乳腺癌临床病理特征的关系

2.3 RNF2 mRNA在乳腺癌细胞系和乳腺上皮细胞系中的表达 qRT-PCR结果显示：RNF2 mRNA在MCF-10A和HMEC乳腺上皮细胞系中低表达；在BT549、SKBR3、T47D、MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞系中高表达，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

3 讨论

图2 qRT-PCR法检测RNF2 mRNA在乳腺上皮细胞系和乳腺癌细胞系中的表达

RNF2又称RING1B，属于PcGs的一员。PcGs基因首先在果蝇中发现，被认为可维持Hox等生长调控因子的表达水平，具有促进组蛋白脱去乙酰基尾，阻滞ATP依赖的染色体重塑，从而抑制基因转录的作用。据报道，PcGs参与多种细胞生命活动，包括细胞周期调控、癌症、老化、X染色体失活、决定细胞结局及干细胞分化。在哺乳动物中，PcGs包含两个核心组件，分别是多梳抑制复合体1和2(PRC1和PRC2)。人PRC1复合体包含CBX2、CBX4、CBX6、CBX7、CBX8、PHC1、PHC2、PHC3、BMI1、MEL18、MBLR、NSPC1、RING1A和RING1B。人PRC2复合体包含EZH1、EZH2/ENX1/KMT6、SUZ12和EED。PcGs主要通过表观遗传学事件抑制靶基因的活性、参与癌症的发生、发展、调控，如DNA甲基化、组蛋白脱甲基化、巨组蛋白H2A联系、组蛋白脱乙酰基等。Bmi1是PcGs家族中第一个被发现具有促癌作用的蛋白，其与MYC基因协同促进B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤的发生；后续PcGs家族其他成员均发现与肿瘤进展相关，如SUZ12、EZH2、PCL3、RAE28等。RNF2作为PRC1的重要成员，具有环指结构域，凭借其E3连接酶的特性，催化组蛋白H2A 119位赖氨酸单泛素化，从而可通过压缩染色质造成基因沉默并抑制转录延长阶段的进行，在干细胞增殖分化、维持干细胞自我更新能力与肿瘤的发生、发展中发挥一定作用[4-8]。

研究表明，RNF2在恶性肿瘤中高表达，发挥促癌作用。Yang等[9]发现在食管癌组织中RNF2蛋白显著高表达，与肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移相关，且与患者预后呈负相关；Li等[10]通过免疫组化和FISH法在侵袭性卵巢癌中发现，RNF2蛋白和基因高表达，与TNM分期、组织学分级、FIGO分期及Ki-67增殖指数密切相关；Li等[11]运用免疫组化和FISH法发现RNF2蛋白及基因在膀胱尿路上皮癌中表达显著高于膀胱黏膜，但其高表达与临床病理特征无相关性，而与患者预后不良相关；Chen等[12]通过免疫组化法发现RNF2蛋白在胰腺癌组织中定位于细胞核，且呈高表达；而在癌旁正常胰腺组织中低表达，癌组织中高表达RNF2与患者5年生存率呈负相关。本实验分析发现RNF2蛋白在乳腺癌中高表达，阳性率高于其在乳腺良性病变组织，提示乳腺癌中RNF2可能发挥促癌作用；本实验还发现RNF2蛋白在乳腺癌组织中主要定位于细胞核与细胞质，而以往报道主要定位于细胞核，可能与抗体来源不同相关；临床病理特征分析RNF2阳性与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期有关，而与患者年龄、组织学分级、ER、PR、HER-2表达情况无关，与文献报道结果相符，提示RNF2阳性可能与乳腺癌转移、侵袭存在一定联系。本实验未分析RNF2蛋白表达与乳腺癌患者预后、Ki-67增殖指数的联系，将在后续实验中进行进一步分析。

有研究表明RNF2对肿瘤细胞的侵袭、迁移，细胞增殖及细胞凋亡存在一定作用。Bosch等[13]运用免疫组化法发现RNF2蛋白在乳腺癌组织中高表达，其在乳腺癌细胞系中通过维持Fak表达水平促进细胞侵袭、迁移能力；Yang等[9]报道在食管癌细胞系中沉默RNF2的表达，细胞增殖受到抑制，且促进体内外实验中癌细胞对放射的敏感性；周春辉等[14]报道下调RNF2的表达促进胶质瘤细胞凋亡并增强其放射敏感性。RNF2对肿瘤的调控作用可能是通过MDM2-p53通路介导发挥的。RNF2负性调控p53基因的表达，主要通过直接与p53、MDM2结合，促进MDM2介导的p53泛素化降解；同时延长MDM2的半衰期，抑制其自身泛素化降解[15-16]。本实验在体外细胞系中检测RNF2 mRNA水平，同免疫组化结果一致，乳腺癌细胞系中RNF2基因表达水平高于乳腺上皮细胞系，为进一步体外细胞功能实验提供充足依据，从而后续可根据各个乳腺癌细胞系中RNF2 mRNA相对水平进行更加完善的功能和机制实验。

综上所述，乳腺癌中E3连接酶RNF2高表达，与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期相关，可能与乳腺癌转移、侵袭相关，为乳腺癌提供一个潜在的治疗靶点。

[1] Chen W Q, Zheng R S, Baade P,etal. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[2] Scelfo A, Piunti A, Pasini D. The controversial role of the polycomb group proteins in transcription and cancer: how much do we not understand polycomb proteins[J]? FEBS J, 2015,282(9):1703-1722.

[3] 刘 标，周晓军. 解读2012年WHO 乳腺肿瘤分类[J]. 临床与实验病理学杂志, 2012,28(11):1185-1187.

[4] Morey L, Helin K. Polycomb group protein-mediated repression of transcription[J]. Trends Biochem Sci, 2010,35(6):323-332.

[5] Ohtsubo M, Yasunaga S, Ohno Y,etal. Polycomb-group complex 1 acts as an E3 ubiquitin ligase for geminin to sustain hematopoietic stem cell activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105(30):10396-10401.

[6] Levine S S, Weiss A, Erdjument-Bromage H,etal. The core of the polycomb repressive complex is compositionally and functionally conserved in flies and humans[J]. Mol Cell Biol, 2002,22(17):6070-6078.

[7] Zhou W, Zhu P, Wang J,etal. Histone H2A monoubiquitination represses transcription by inhibiting RNA polymerase II transcriptional elongation [J]. Mol Cell, 2008, 29(1):69-80.

[8] Sparmann A, van Lohuizen M. Polycomb silencers control cell fate, development and cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2006,6(11):846-856.

[9] Yang X X, Ma M, Sang M X,etal. Radiosensitization of esophageal carcinoma cells by knockdown of RNF2 expression[J]. Int J Oncol, 2016,48(5):1985-1996.

[10] Li X Q, He W P, Hou W H,etal. Overexpression of RNF2 is positively associated with ovarian carcinoma aggressiveness and indicative of poor patient survival[J]. Oncotarget, 2016. doi: 10.18632/oncotarget.8975.

[11] Li X D, Chen S L, Dong P,etal. Overexpression of RNF2 is an independent predictor of outcome in patients with urothelial carcinoma of the bladder undergoing radical cystectomy[J]. Sci Rep, 2016,6:20894.

[12] Chen J, Xu H, Zou X,etal. Snail recruits ring1B to mediate transcriptional repression and cell migration in pancreatic cancer cells[J]. Cancer Res, 2014,74(16):4353-4363.

[13] Bosch A, Panoutsopoulou K, Corominas J M,etal. The polycomb group protein RING1B is overexpressed in ductal breast carcinoma and is required to sustain FAK steady state levels in breast cancer epithelial cells[J]. Oncotarget, 2014,5(8):2065-2076.

[14] 周春辉，杨 帆，席文锦，等. 下调环指蛋白2的表达促进U87脑胶质瘤细胞凋亡并增强其放射敏感性[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2014,30(5):471-475.

[15] Wen W, Peng C, Kim M O,etal. Knockdown of RNF2 induces apoptosis by regulating MDM2 and p53 stability [J]. Oncogene, 2014,33(4):421-428.

[16] Su W J, Fang J S, Cheng F,etal. RNF2/Ring1b negatively regulates p53 expression in selective cancer cell types to promote tumor development [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013,110(5):1720-1725.

Expression of RNF2 in breast carcinoma and its significance

LI Qing1, WU Zheng-sheng1, SHEN Yu-jun2, FENG Li-jie2, SHEN Yu-xian2

(1DepartmentofPathology,2InstituteofBiopharmaceuticals,SchoolofBasicMedicalScience,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the expression of RNF2 in breast disease tissues and cell lines, and to analyze the association between expression of RNF2 and clinicopathological characteristics in breast carcinoma. Methods Expression of RNF2 protein and mRNA levels was detected using immunohistochemistry of EnVision two-step and qRT-PCR in breast carcinoma and benign breast disease as well as in cell lines. Results RNF2 expression was significantly higher in breast carcinoma tissue specimens compared with benign breast disease specimens (P<0.05). Besides, the expression of RNF2 protein was significantly associated to tumor size, lymph node status and TNM stage (P<0.05 for both), but was not related to age, histological grade, the expression of ER, PR and HER-2 (P>0.05 for both). Higher expression of RNF2 mRNA was detected in breast carcinoma cell lines compared with breast epithelial cell lines (P<0.05). Conclusion RNF2 is overexpressed in breast carcinoma and can be a potential therapeutic target for breast carcinoma.

breast neoplasm；RNF2；immunohistochemistry；qRT-PCR

时间：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.001.html

国家自然科学基金(81472493、81372576)、安徽省学术和技术带头人及后备人选科研活动经费(2016H074)

安徽医科大学1病理学教研室、2基础医学院生物药物研究所，合肥 230032

李 庆，女，硕士研究生。E-mail: 863665545@qq.com 吴正升，男，博士，教授，通讯作者。E-mail: woozson@126.com

R 737.9

A

1001-7399(2017)03-0237-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.001

接受日期：2017-01-10