不同免疫组化法检测PHH3蛋白染色的比较

高丽丽，朱长乐

不同免疫组化法检测PHH3蛋白染色的比较

高丽丽，朱长乐

PHH3；免疫组织化学；抗原修复

组蛋白H3是细胞核染色质的重要组成成分，也是核心组蛋白之一[1-2]。PHH3是磷酸化的组蛋白H3，其只存在细胞有丝分裂期而不出现于分裂间期和凋亡细胞中，从而有利于有丝分裂细胞的计数[1-4]。Ribalta等[4]报道PHH3蛋白可以帮助脑膜瘤的肿瘤分级以及区分凋亡细胞；在皮肤的平滑肌肿瘤中简单计数核分裂细胞[5]；Tsuta等[6]认为，PHH3同样可以在肺神经内分泌癌中计数核分裂细胞；除此之外，PHH3还可以预测星形细胞瘤患者的生存期[7]，协助子宫内膜癌的病理分级等[8]。因此采用免疫组化(immunohistochemistry, IHC)检测PHH3蛋白表达具有重要意义，本文现采用不同IHC法检测PHH3，探讨最佳染色方案。

1 材料与方法

1.1 材料 收集江苏省中医院病理科不同肿瘤组织石蜡标本50例(胃肠道间质瘤19例、乳腺浸润性导管癌2例、节细胞神经瘤1例、子宫平滑肌瘤11例、神经鞘瘤3例、肾上腺皮质腺瘤6例、脂肪肉瘤3例、胶质母细胞瘤4例、脑膜瘤1例)，其中19例有核分裂象的肿瘤组织采用IHC法检测PHH3蛋白表达。一抗PHH3分别为RAB-0693(福州迈新公司)、ZA-0477(北京中杉金桥公司)产品，二抗EliVision购自福州迈新公司，修复液分别购自福州迈新、DAKO、罗氏公司，其余试剂均购自福州迈新公司。

1.2 方法 (1)石蜡切片(3 μm)，烤片(65 ℃ 1 h)，二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水化，自来水冲洗；(2)3种抗原修复方法分别为：柠檬酸盐(pH 6.0)高压100 ℃修复2 min；DAKO公司的EnVision FLEX修复液(pH 9.0)96 ℃，20 min；Ventana的CC1修复液(pH 8.0)，95～100 ℃ 30 min；(3)PBS(pH 7.2～7.4)洗涤，每次3 min；(4)非免疫羊血清孵育，RT，10 min；(5)一抗孵育，4 ℃过夜；(6)室温放置30 min使切片恢复至常温，PBS洗涤，每次3 min；(7)二抗孵育，RT，A、B液分别15 min，PBS洗涤，每次3 min；(8)DAB显色，RT，3 min；(9)自来水冲洗，苏木精复染1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。

2 结果

2.1 PHH3蛋白在肿瘤组织中的表达 PHH3蛋白在肿瘤组织中定位于细胞核(图1)。

2.2 不同IHC法检测PHH3蛋白染色比较 50例肿瘤组织HE染色，选取有核分裂象的组织19例进行IHC染色，当抗原修复采用柠檬酸盐(pH 6.0)高压100 ℃修复2 min，分别标记两种PHH3一抗，染色结果为：PHH3(RAB-0693)标记的组织背景染色深，出现大量假阳性，4例表达较弱；PHH3(ZA-0477)标记的组织有非特异性着色，15例出现假阴性(图2)。当抗原修复方法采用DAKO公司的EnVision FLEX修复液(pH 9.0)经96 ℃修复20 min，分别标记一抗PHH3后染色结果与柠檬酸盐修复方法相比，PHH3(RAB-0693)标记的组织背景染色加深，阳性强度提高，但仍出现大量假阳性结果；PHH3(ZA-0477)标记的组织仍存在非特异性着色和假阴性表达(图3)。当采用Ventana的CC1修复液(pH 8.0)经95～100 ℃修复30 min，分别标记一抗后染色结果相比，前两种修复方法：PHH3(RAB-0693)标记的组织无背景染色，阳性表达提高，定位明确；PHH3(ZA-0477)标记的组织非特异性着色减弱，阳性表达定位仍不明确，存在假阴性(图4)。

3 讨论

PHH3蛋白与真核细胞中染色质凝集状态密切相关。用IHC法检测不同肿瘤组织中PHH3蛋白，观察核分裂象可有效评价核分裂能力。本实验共选取肿瘤组织石蜡标本50例，HE染色中13例胃肠道间质瘤有核分裂象，1例浸润性乳腺癌，3例肾上腺皮质腺瘤，1例脂肪肉瘤，1例胶质母细胞瘤。IHC染色结果受多种因素影响，其中组织固定影响最大[9]，但本实验主要从IHC流程本身分析影响因素。其要点概括：(1)抗原修复，目的是为了暴露组织抗原决定簇，有利于与抗体的结合，当抗原暴露不足时，染色结果减弱。影响抗原修复的因素有pH和温度，不同的抗原决定簇所需的pH不同；目前大多采用热修复方法，温度过低也会使抗原暴露不充分。本实验中pH 8.0的CC1修复液抗原修复效果最佳。(2)一抗的选择，一抗是影响IHC染色结果的关键因素。本实验中PHH3(RAB-0693)的染色效果佳。(3)一抗孵育条件，一般采用4 ℃过夜、室温或37 ℃ 1 h，本实验条件为4 ℃过夜孵育。(4)放大系统，也就是二抗的选择，本实验使用EliVision系统。

图1 胃肠道间质瘤组织PHH3蛋白表达,EliVision法 图2 柠檬酸盐修复,EliVision法:A.一抗为PHH3(ZA-0477);B.一抗为PHH3(RAB-0693) 图3 EnVisionFLEX修复,EliVision法:A.一抗为PHH3(ZA-0477);B.一抗为PHH3(RAB-0693) 图4 Ventana的CC1修复液修复，EliVision法：A.一抗为PHH3(ZA-0477)；B.一抗为PHH3(RAB-0693)

总之，IHC检测是细致耐心的工作，需要病理医师在日常工作中不断总结经验，优化实验流程，制定适合自己实验室的标准流程，最终做出优质的免疫组化切片。

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时间：2017-3-16 14:23

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170316.1423.031.html

南京中医药大学附属医院/江苏省中医院病理科，南京 210029

高丽丽，女，硕士，技师。E-mail： 278304371@qq.com 朱长乐，男，副主任技师，通讯作者。Tel: (025)86553357，E-mail： zhuchangle2008@163.com

R 329.33

B

1001-7399(2017)03-0344-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.03.031

接受日期：2017-01-29