孟鲁司特抑制RSV感染人支气管上皮细胞所致炎症作用研究

江敏时 檀卫平 郭奕文 邹志浩

孟鲁司特抑制RSV感染人支气管上皮细胞所致炎症作用研究

江敏时 檀卫平 郭奕文 邹志浩

目的以呼吸道合胞病毒(RSV)感染人支气管上皮细胞株(16HBECs)为模型, 探讨孟鲁司特在抑制炎症过程中的药理作用机制。方法建立RSV感染的16HBECs的炎症模型, 给予不同滴度的RSV作用, 收集上清液, 用酶联免疫吸附试验(ELISA)两次检测细胞上清液中炎症因子的表达。CCK-8法检测药物对16HBECs的生长影响。结果造模过程中随RSV感染滴度的增多, 16HBECs分泌的白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6越多(P＜0.05)；同一感染滴度RSV作用时间越长,炎症因子的分泌量持续升高。12 mg/L及以下药物浓度的孟鲁司特和1∶320及以下稀释倍的利巴韦林对细胞增殖没有抑制作用。与感染RSV组相比, 高中剂量孟鲁司特组较利巴韦林组抑制炎症因子的作用明显(P＜0.05)。结论孟鲁司特能抑制RSV感染人支气管上皮细胞所致炎症作用。

孟鲁司特；人支气管上皮细胞；呼吸道合胞病毒；炎症

支气管哮喘是一种由T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等众多因素共同介导的呼吸道炎症疾病。RSV容易感染婴幼儿、老年人等, 引起毛细支气管炎症和肺炎。孟鲁司特是一种选择性半胱氨酰白三烯受体(CysL1Rs)拮抗剂, 在国内外临床上都是治疗哮喘的首选药物。有研究发现孟鲁司特具有非CysL1Rs依赖性的更加广谱的抗炎性, 可作用于免疫活性细胞如嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、中性粒细胞等［1］, 其作用机制不太明确, 更需广大科研人员的深入研究探讨。

1 材料与方法

1. 1 实验试剂与设备细胞和病毒：人喉鳞癌上皮细胞株(HEp-2细胞)、16HBECs、RSV-Long毒株A2型；药物和试剂：孟鲁司特钠、利巴韦林注射液(1 ml∶100 mg)。高糖DMEM培养基、胎牛血清；CCK-8试剂；IL-1β、TNF-α、IL-6、ELISA 试剂盒；设备：低温高速离心机；Thermo酶标仪。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 建立RSV感染的16HBECs的炎症模型Hep-2细胞、16HBECs生长培养采用高糖DMEM培养基, 细胞生长环境为37℃、5% CO2、95%湿度培养箱下培养。每隔2～3 d传代一次, 取对数期生长的细胞试验。

1. 2. 2 RSV 培养及组织培养感染量(TCID50)测定用Hep-2细胞对RSV进行扩增。当细胞病变(cytopathic effect, CPE)总数达到80%时收集细胞, 于-80℃/37℃的条件中反复冻融3次, 最后一次冻融尽量最大程度的收集细胞, 使之释放病毒。将收集得来的细胞悬液在低温离心机上2500 r/min, 离心10 min, 收集上清液, 采用0.22 μm滤膜过滤, 得到病毒悬液,沉淀则弃之。然后分装后于-80℃保存。按依Reed-Muench两氏法计算TCID50。

1. 2. 3 RSV诱导16HBECs炎症模型的建立不同滴度的病毒的培养基作为RSV 感染组, 设不含滴度病毒培养基的正常细胞对照组。收集12～72 h内被感染不同滴度的RSV的16HBECs上清液, 待测炎症因子。

1. 2. 4 孟鲁司特对RSV所致16HBECs炎症的影响CCK-8法检测孟鲁司特对细胞的毒性：细胞存活率=药物作用孔的OD值/正常对照组的OD值。确定各药物的最大无毒浓度。ELISA按试剂盒说明书进行检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α。

1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 多组比较采用单因素方差分析, 多组组间对比采用LSD检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 RSV毒力测定每50 μl的原液含104.7TCID50, 病毒滴度为104.7TCID50/50 μl。

2. 2 RSV诱导16HBECs炎症模型的建立随着RSV感染滴度的增多, IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌量呈上升趋势(P＜0.05),随感染时间延长, 相同滴度水平下IL-1β、TNF-α、IL-6的分泌量与12 h相比较也持续增多(P＜0.05)。

2. 3 孟鲁司特对RSV所致16HBECs炎症的影响

2. 3. 1 药物毒性测定24 mg/L及48 mg/L的孟鲁司特、1∶320以上稀释倍数利巴韦林对16HBECs是有一定的抑制作用的, 12 mg/L及以下浓度的孟鲁司特、1∶320及以下的稀释倍数利巴韦林对细胞的生长均无明显的抑制作用。

2. 3. 2 孟鲁司特对RSV所致16HBECs炎症的影响高中低三个剂量的孟鲁司特钠组、利巴韦林组与模型组比较, 三个炎症因子的表达水平都有显著的降低(P＜0.05)；高中剂量组分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α的含量比利巴韦林组分泌的量低(P＜0.05)。见表1。

表1 孟鲁司特对RSV所致16HBECs炎症因子的影响

表1 孟鲁司特对RSV所致16HBECs炎症因子的影响

注：与对照组比较,aP＜0.05；与模型组比较,bP＜0.05；与利巴韦林组比较,cP＜0.05

3 讨论

该实验成功建立了永久性RVS感染人支气管上皮细胞的模型并开展后续的研究。有体内外研究表明, RSV感染的气道上皮细胞分泌高水平的IL-6、IL-1β、IL-8能调节刺激正常T细胞的表达, 调节活化正常T细胞表达以及其他促炎症因子和趋化因子［2-6］。

孟鲁司特是我国临床上用于治疗小儿支气管哮喘的指南, 作为一种新型的非甾体类抗炎药, 还具有一系列CysLT1Rs非依赖性的次级抗炎性, 抑制嗜酸性粒细胞在气道血管内皮的粘附于迁移活动［1,7-9］。孟鲁司特单用对轻度持续性哮喘小儿有较好的治疗效果, 并且副作用小［10-12］。

研究表明, 造模过程中随RSV感染滴度的增多, 16HBECs分泌的IL-1β、TNF-α、IL-6越多(P＜0.05)；同一感染滴度RSV作用时间越长, 炎症因子的分泌量持续升高(P＜0.05)。12 mg/L及以下药物浓度的孟鲁司特和1∶320及以下稀释倍的利巴韦林对细胞增殖没有抑制作用。与感染RSV组相比,高中剂量孟鲁司特组较利巴韦林组抑制炎症因子的作用明显(P＜0.05)。孟鲁司特对炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6这三个指标都能明显的改善。但孟鲁司特抑制炎症反应机制目前为止尚未十分明确, 阐明其对炎症反应的影响对支气管哮喘的治疗具有深远的意义。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.08.074

2017-03-21］

510800 广州市中西医结合医院(江敏时 郭奕文邹志浩)；中山大学孙逸仙纪念医院(檀卫平)