中频交变电流联合紫杉醇抗乳腺癌MCF-7细胞作用的研究

谢 青，王晓文，汪 悦，张北山，张丽岩，路晓光，毛 昀，唐劲天，李利亚⋆

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院 中西医结合肿瘤科，北京 100029；3.清华大学工程物理系 医学物理与工程研究所医疗新技术实验室，北京 100084）

中频交变电流联合紫杉醇抗乳腺癌MCF-7细胞作用的研究

谢 青1，2，王晓文3，汪 悦3，张北山3，张丽岩3，路晓光2，毛 昀2，唐劲天3，李利亚2⋆

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院 中西医结合肿瘤科，北京 100029；3.清华大学工程物理系 医学物理与工程研究所医疗新技术实验室，北京 100084）

目的：研究中频交变电流联合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7细胞的作用。方法：将对数生长期的乳腺癌细胞分别暴露于电刺激、紫杉醇、电刺激与紫杉醇联合作用下，采用cck8法检测细胞存活率，并运用流式细胞技术分析各组实验作用下对细胞凋亡/死亡、细胞周期的影响。结果：中频交变电流（100kHz，110mA，30min）作用MCF-7细胞后，细胞存活率为70±5.24%，联合紫杉醇（IC50）治疗后，细胞存活率为24±1.81%（P＜0.01）；中频交变电流联合紫杉醇能够增加细胞凋亡率，阻滞细胞于S期、G2/M期。结论：中频交变电流单独使用可以抑制MCF-7细胞增殖，联合紫杉醇应用时能表现出协同抑制肿瘤细胞生长的作用。

中频交变电流；紫杉醇；人乳腺癌MCF-7细胞；细胞周期；凋亡

Author’s addressBeijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

中频交变电场（100～300kHz，1～2V/cm），亦称肿瘤治疗电场（tumor treating fields，TTFields），在抗肿瘤作用领域具有独特的生物学机制和效应，如引起Septin 2、6、7蛋白定位障碍[1]，干扰α/β微管聚合，影响纺锤体的形成，使肿瘤细胞有丝分裂中期异常中断[2，3]，减少 CD34（+）细胞，抗血管生成[4，5]和p53依赖，引起肿瘤细胞免疫原性死亡，且副反应较低，已被FDA批准正式应用于临床治疗复发脑胶质母细胞瘤[6，7]。而交变电流不仅具有抗肿瘤作用[8]，还可以减少耐药蛋白在肿瘤细胞中的表达，增加肿瘤细胞对化疗药物的摄取，协同化疗药物抑制肿瘤细胞增殖[9]。电流和电场具有的生物学效应，在医学上的运用越来越广[10]。目前已针对不同类型肿瘤，如脑胶质母细胞瘤[11]、非小细胞肺癌[12]、胰腺癌[13]、前列腺癌[14]等开展了一系列基础实验及临床研究，并取得一定的抗肿瘤效果。

本实验室自2008年开始，首次将中频电场和电流结合，即中频交变电流（alternating current at intermediate frequency，ACIF）。已证实中频交变电流对人肝癌HepG2细胞、BEL-7402细胞、人神经胶质瘤细胞U251、乳腺癌MCF-7细胞等具有不同程度的抑制作用[15]。化疗药物紫杉醇能够抑制细胞微管解聚，促进微管聚合并稳定微管，阻滞细胞于G2/M期，达到抗肿瘤目的。然而，近年来肿瘤细胞对紫杉醇耐药性逐渐增加，迫切需要找到新的方法与紫杉醇联合使用，增加抗肿瘤疗效。因此，本实验将进一步研究ACIF联合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7细胞作用效果。

1 材料

1.1 细胞株

人乳腺癌MCF-7细胞株，由北京协和细胞库提供。

1.2 仪器设备

中频交变电流治疗仪，清华大学医疗新技术实验室研发；电极：铂金材质。多功能读数仪-酶标仪，美国Thermo Scientific公司；BD FACSCalibur型流式细胞分析仪，美国BD公司。

1.3 药品与试剂

紫杉醇（紫素），批号：国药准字H10980069，购自北京协和药厂；cck8试剂盒，日本同仁化学研究所；RPMI-1640培养基，美国Gibco公司；胎牛血清（FBS），美国Hyclone公司；细胞DNA含量（细胞周期）即时检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养

将人乳腺癌MCF-7细胞以1×104/ml浓度接种于25cm2培养瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，放置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。进行细胞实验时，将处于对数生长期的细胞用PBS洗3次，胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基终止消化，吹打混匀（避免气泡产生），吸入到离心管中离心，倒掉上清液，加入适量的培养基，调整所需细胞浓度至1.5×104/ml。

2.2 不同中频交变电流对MCF-7细胞增殖的研究

设置对照组：正常培养细胞；电刺激组：选取中频交变电流参数100kHz、30min，分别予50mA、70mA、90mA、110mA、130mA、150mA的电流刺激细胞，每个电刺激组设置4个复孔。取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度至1×104/ml，每孔2ml，接种于24孔板中，37℃、5%CO2的培养箱中培养24h后，分别予中频交变电流刺激MCF-7细胞，每隔24h刺激1次，共3次。刺激结束后，弃去培养基，每孔避光加入 0.5ml的cck8工作液，37℃、5%CO2的培养箱中避光孵育2h，用酶标仪检测450nm波长处各孔的OD值。细胞存活率（%）=实验组OD/对照组OD×100%。

2.3 不同紫杉醇药物浓度抑制MCF-7细胞的生长情况

设置对照组：正常培养细胞；紫杉醇组：调整紫杉醇的药物培养基浓度分别为：0.01、0.1、1、10、100、1000nmol/L，每一物质的量浓度设置4个复孔。取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度至1×104/ml，每孔2ml，接种于24孔板中，37℃、5%CO2的培养箱中避光培养24h后，换上含有上述紫杉醇的药物培养基避光培养。培养72h后，测定各组的OD值（方法同“2.2”项）。

2.4 中频交变电流联合紫杉醇对MCF-7细胞增殖的影响

设置对照组：正常培养细胞；电刺激组：刺激参数为100kHz，110mA，30min；紫杉醇组：物质的量浓度为31nmol/L（IC50）；联合组：电刺激+紫杉醇组。取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度至1×104/ml，每孔2ml，接种于24孔板中，每组4个复孔，37℃、5%CO2的培养箱中避光培养24h后，紫杉醇组与联合组分别换上31nmol/L的紫杉醇药物培养基。每隔24h分别予中频交变电流作用于电刺激组与联合组1次，共3次。刺激结束后，测定各组的OD值（方法同“2.2”项）。

2.5 中频交变电流联合紫杉醇抑制MCF-7细胞后的恢复时间研究

分组方法同“2.4”项。各实验组细胞分别在24h内暴露于电刺激、紫杉醇药物及联合作用，再换上正常培养基。分别于24、48、72h检测各组的OD值（方法同“2.2”项）。

2.6 流式细胞术检测MCF-7细胞凋亡/死亡及细胞周期

分组方法同“2.4”项。取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度至1.5×104/ml，每孔2ml，接种于24孔板中，每组8个复孔，37℃、5%CO2的培养箱中避光培养24h后，紫杉醇组与联合组分别换上31nmol/L的紫杉醇药物培养基。每隔24h分别予中频交变电流作用于电刺激组与联合组1次，独立实验共3次。

表1 不同ACIF刺激后肿瘤细胞的存活率（%）

表2 不同浓度紫杉醇对MCF-7细胞增殖的影响

2.6.1 细胞凋亡/死亡

各组细胞用不含EDTA的胰酶消化搜集到离心管，于2000r/min离心10min，弃去上清液，用PBS洗涤2次，加入500滋l的Binding Buffer悬浮细胞，予5滋l Annexin V-FITC混匀后，再加入5ul Propidium Iodide混匀，室温避光反应10 min，流式细胞仪检测。

2.6.2 细胞周期

各组细胞用胰酶消化搜集到离心管，于2000r/min离心10min，弃去上清液，用PBS洗涤细胞1次，于2000r/min离心5min，搜集并调整细胞浓度为1×106/ml，取1ml单细胞悬液离心，弃去上清液，在细胞中加入体积分数为70%的冷乙醇500ul固定2h，4℃保存。2000r/min离心10min，弃去上清液，加入100滋l RNase A 37℃水浴30min，再加入400滋l PI染色混匀，4℃避光30min，流式细胞仪检测。

2.7 统计学方法

应用SPSS20.0统计软件，数据间比较采用t检验。

3 结果

3.1 不同中频交变电流对MCF-7细胞增殖的影响

随着电流增加，乳腺癌MCF-7细胞的存活率越来越低，表明中频交变电流对MCF-7人乳腺癌细胞具有较好的抑制作用（见表1）。

3.2 不同紫杉醇药物浓度抑制MCF-7细胞的生长情况

随着紫杉醇药物浓度的增加，其对MCF-7人乳腺癌细胞的抑制率越来越强，紫杉醇对MCF-7细胞的IC50为31nmol/L（见表2）。

3.3 中频交变电流联合紫杉醇对MCF-7细胞增殖的影响

中频交变电流联合紫杉醇（IC50）作用于MCF-7细胞，细胞存活率为24±1.81%，相对于紫杉醇组：52±3.97%，MCF-7人乳腺癌细胞存活率明显降低（P＜0.01）。由此可知，中频交变电流（ACIF）联合紫杉醇对MCF-7人乳腺癌细胞具有协同杀伤作用。

3.4 对MCF-7细胞治疗24h后恢复时间过程的影响

各实验组在24h内治疗后，均可见对MCF-7细胞有不同程度的抑制作用。其中与对照组相比，电刺激组及紫杉醇组的人乳腺癌MCF-7细胞减少近30%，联合组的人乳腺癌MCF-7细胞减少近50%，达到半数抑制量。在接下来的48h期间，电刺激组相对于药物组，细胞恢复较快；联合组、药物组恢复较慢；其中，联合组细胞存活率最低，仅33%（见图1）。

3.5 对MCF-7细胞凋亡/死亡的影响

图1 各组作用24h内的恢复时间

图2 中频交变电流联合紫杉醇对MCF-7细胞凋亡/死亡的影响（A：对照组；B：电刺激组；C：紫杉醇组；D：联合组）

流式细胞仪分析结果显示，单独电刺激组及紫杉醇组能够促进MCF-7细胞凋亡，在中频交变电流联合紫杉醇作用后，人乳腺癌MCF-7细胞凋亡率明显增加，与其它3组相比有显著性差异，说明中频交变电流联合紫杉醇能诱导MCF-7细胞凋亡（见图2）。

3.6 对MCF-7细胞周期的影响

流式细胞仪分析结果显示，治疗3d后，各实验组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞明显增多，其中，联合治疗组G2/M期细胞明显增多，说明中频交变电流联合紫杉醇能改变MCF-7细胞周期，将MCF-7人乳腺癌细胞阻滞于S期、G2/M期（见图3，封二）。

4 讨论

中频交变电流（ACIF）结合了电流和电场的特性，是本实验室首创。研究表明[8，10]，中频交变电流可以影响人乳腺癌MCF-7细胞周期，使细胞分裂滞后，诱导细胞凋亡，且对正常细胞没有明显的影响。另外，微管在细胞有丝分裂进程中有着重要的作用，中频交变电场能够干扰肿瘤细胞微管，影响纺锤体形成，抑制细胞有丝分裂[16]。大多数以微管为作用靶点的药物，如紫杉醇类、长春碱类、秋水仙碱、自念珠藻环肽，能阻止细胞分裂于G2/M期，Artelastin、龙葵素等干扰细胞于 S期[17，18]，诱导细胞凋亡。而紫杉醇是临床指南推荐使用的治疗复发乳腺癌的常用化疗药物，还没有进行中频交变电流与紫杉醇联合作用于乳腺癌MCF-7细胞的研究。因此，本实验为首次探究中频交变电流联合紫杉醇抗人乳腺癌MCF-7细胞的作用效果。

本实验通过cck8法测得中频交变电流联合紫杉醇 （IC50）对MCF-7细胞的存活率为24± 1.81%，表明中频交变电流能协同紫杉醇增加细胞毒作用；流式细胞仪检测显示，经中频交变电流联合紫杉醇治疗3d后，G0/G1期细胞百分比明显减少，仅占18.53±3.25%，而S期细胞及G2/M期细胞百分比（分别为50.94±3.11%、30.53±2.09%，P＜0.01）明显增多，因此推断中频交变电流联合紫杉醇能将MCF-7细胞阻滞在S期、G2/M期。细胞周期的紊乱是肿瘤发生发展的重要特征[19]。研究发现[20，22]，在乳腺癌发生发展过程中，细胞周期蛋白（cyclin）D1可以缩短G1期，使细胞进入S期，过度表达可致乳腺导管增生和导管癌；cyclin E过度表达可以缩短G1期，形成不稳定的染色体，诱导肿瘤细胞生成、恶化。细胞周期蛋白依赖性激酶 （cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂p21、p27能够与cyclin-CDK结合，抑制其催化活性，使细胞周期停滞[23]。我们猜测，中频交变电流联合紫杉醇能将MCF-7细胞阻滞于S、G2/M期，可能与cyclin D1、E及CDK抑制剂p21、p27有一定的关系。在流式细胞仪检测细胞凋亡/死亡中，联合组正常细胞百分比仅占1.3±0.45%，而凋亡细胞百分比高达91.3±0.93%，可以看出，中频交变电流能够协同紫杉醇促进MCF-7细胞凋亡。我们猜测，中频交变电流能够协同紫杉醇促进细胞微管聚合，防止其解聚，阻滞细胞于S期、G2/M期，使肿瘤细胞有丝分裂中断，共同发挥着诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的作用。

中频交变电流（ACIF）无创或微创的疗法，可显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并提高化疗效果，为乳腺癌的治疗和乳腺癌化疗的增敏提供了新的思路。

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Inhibiting human breast cancer MCF-7 cells proliferation with alternating current at intermediate frequency combined with paclitaxel in vitro/

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XIE Qing，WANG Xiao-wen，WANG Yue，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Feb，31（1）：26-30

Objective：To investigate the effect of alternating current at intermediate frequency（ACIF）in combination with Paclitaxel on cell proliferation of MCF-7 cells in vitro.Methods：Cell proliferation in culture was studied in human breast MCF-7 cell lines exposed to ACIF，Paclitaxel separately and in combinations.The growth rate of MCF-7 cells was evaluated by cck8 assay；cell apoptosis/death and cycle of MCF-7 cells were analyzed by a flow cytometry.Results：The survival rate of MCF-7 cells exposed to ACIF（100kHz，110mA，30 min）was 70±5.24%，but significantly decreased to 24±1.81%in combination with Paclitaxel（P＜0.01）.Moreover，ACIF in combination with Paclitaxel could promote MCF-7 cells apoptosis and induce cell growth arrest in S phase and G2/M phase.Conclusion：ACIF alone could inhibit MCF-7 cells proliferation and enhance the inhibitory effect ofpaclitaxel.

alternating current at intermediate frequency；Paclitaxel；human breast MCF-7 cells；cell cycle；apoptosis

R730.59；R454.1

A

1001-0025（2017）01-0026-05

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.01.007

国家自然科学基金（81372412）。

2* 本文通讯作者。

谢 青（1991-），男，硕士研究生。

2016-08-17

2016-12-08