心力衰竭大鼠心肌SERCA2a和miR-25-3p/5p表达的改变及泻肺利水方药的干预作用*

吴锦波， 叶小汉， 冼绍祥， 董明国

(1. 广州中医药大学博士后流动站， 广州 510405； 2. 东莞市中医院心内科， 东莞 523000；3. 广州中医药大学第一附属医院心内科， 广州 510405)

心力衰竭大鼠心肌SERCA2a和miR-25-3p/5p表达的改变及泻肺利水方药的干预作用*

吴锦波1，2， 叶小汉2， 冼绍祥3△， 董明国2

(1. 广州中医药大学博士后流动站， 广州 510405； 2. 东莞市中医院心内科， 东莞 523000；3. 广州中医药大学第一附属医院心内科， 广州 510405)

目的：观察心力衰竭大鼠肌浆网钙ATP酶(SERCA2a)mRNA和miR-25-3p/5p表达水平的变化及中药泻肺利水方药的干预作用。方法：SD大鼠随机分为对照组、模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组(n=10)，阿霉素腹腔注射(总剂量15 ml/kg，2周内分6次注射)建立心力衰竭大鼠模型，5周后分别以蒸馏水(10 ml/(kg·d))、泻肺利水中药(22 g/(kg·d))、卡托普利(19 mg/(kg·d))和地高辛(32 μg/(kg·d))连续灌胃35 d，观察大鼠心肌SERCA2a mRNA、miR-25-3p/5p的表达水平和SERCA2a活性、血浆脑钠肽水平、心输出量和射血分数。结果：模型组大鼠心输出量和射血分数显著降低，心肌SERCA2a mRNA表达水平和活性降低，miR-25-3p和miR-25-5p的表达水平、血浆脑钠肽水平显著升高；泻肺利水中药能提高心肌SERCA2a mRNA表达水平和活性，降低miR-25-3p和miR-25-5p的表达水平，降低血浆脑钠肽水平，提高心输出量和射血分数；卡托普利能提高心肌SERCA2a mRNA表达水平，降低miR-25-3p和miR-25-5p的表达水平，降低血浆脑钠肽水平，提高心输出量；地高辛能提高心肌SERCA2a mRNA表达水平，降低血清脑钠肽水平，提高心输出量。结论：心力衰竭大鼠心肌SERCA2a mRNA的表达下调，miR-25-3p和miR-25-5p的表达上调；泻肺利水方药可以上调SERCA2a mRNA的表达，下调心肌miR-25-3p和miR-25-5p 的表达，改善心功能。【关键词】 泻肺利水方药；心力衰竭；肌浆网钙ATP酶；miRNA-25；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5449.2017.037

慢性心力衰竭( chronic heart failure,CHF)，简称心衰，是多种心血管疾病的终末期表现，随着人口老年化和生活方式的改变，心衰的患病人数不断增加。目前全球已超过3800万[1]，给社会造成沉重的经济负担，已成为一个全球性的公共卫生问题。尽管心衰治疗方案不断优化，但其5年病死率仍高达50%[2]，因此有必要寻求更好的治疗方法。心肌细胞内 Ca2+稳态失衡是CHF发生发展的关键环节，直接影响心肌细胞的收缩舒张功能，引发一系列 Ca2+依赖的信号通路异常,导致心肌细胞结构和功能改变。因此，纠正细胞内Ca2+稳态失衡是心衰治疗策略的研究热点[3]。肌浆网钙ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a)在舒张期重摄Ca2+进入肌浆网，以维持细胞内Ca2+稳态，调节心肌兴奋-收缩耦联；转SERCA2a基因治疗可以改善实验动物和CHF患者的心功能[4]。miR-25可以降低SERCA2a表达，抑制miR-25改善心功能[5]。中药被广泛用于慢性心衰的治疗，但由于作用机制不明确和缺乏令人信服的证据等原因，限制了其进一步应用。泻肺利水中药由东莞市中医院心内科根据中医理论及多年临床实践而研制，功能宣肺平喘、降气利水、益气活血。临床观察显示泻肺利水中药能改善CHF患者心功能，降低脑尿钠肽(brain natriuretic peptide, BNP)，增加患者6 min步行距离，提高患者生活质量[6]，因此，有必要对其作用机制作进一步研究。本实验通过腹腔注射阿霉素建立大鼠心衰模型，观察大鼠心肌SERCA2a mRNA和miR-25-3p/5p的表达水平，探讨泻肺利水方药的干预作用，为心衰治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：健康雄性SD大鼠50只(240±15) g由广州中医药大学动物实验中心提供[动物许可证号：SCXK(粤)2013-0020；动物合格证号：NO.440059000]。SPF级净化空间，生长条件为12 h/12 h光照周期，温度(22±3)℃，相对湿度(40～70)%，自由摄食、饮水。

药物与试剂：实验药物采用指南[7]推荐剂量，并经过人与大鼠体表面积换算，大鼠中药剂量采用换算剂量的2倍。泻肺利水方药由葶苈子15 g 、杏仁10g、茯苓30 g、黄芪15 g 、陈皮6 g、三菱10 g和大枣2 g组成，中药饮片购自东莞市药材公司，由东莞市中医院制成流浸膏，并浓缩至每毫升2.2 g生药，-20℃保存。卡托普利(中美上海施贵宝，批号：AAB9465)配成1.9 mg/ml溶液；地高辛(上海信谊，批号：020150201)配成3.2 μg/ml溶液。阿霉素(Medchemexpress LLC，批号：HY-15142)；氯胺酮(福建古田药业，批号：1504153)；地西泮(天津金耀药业，批号：1507077)。超微量Ca2+-ATP酶检测试剂盒(南京建成，批号：201509)； Rat BNP EIA试剂盒(批号：0828157005，RayBiotech.Inc.)。RT-PCR试剂由DBI公司提供。

主要仪器：HP5500心脏超声仪，美国惠普；电子天平(BS210S)，日本Satorius 公司；超净工作台，苏州净化设备公司；紫外分光光度计(UV-1206)，日本SHIMODZU公司；冷冻离心机(SCR20B)，日本HITACHI公司；低温高速离心机(Z323K)，德国HERMLE公司；GDS7600凝胶扫描系统，英国UVP公司；-20℃、-80℃冰箱，海尔集团；Stratagene Mx3000P Real time PCR仪，美国Agilent公司。

1.2 心衰动物模型制备

SD大鼠适应性喂养1周后，参照文献[8]通过腹腔注射阿霉素(总剂量15 mg/kg，每次2.5 mg/kg，配成0.25 mg/ml溶液，2周内分6次注射)建立大鼠心衰模型。对照组腹腔注射同等剂量生理盐水。首次腹腔注射5周后应用心脏超声仪检测并计算左室短轴缩短率(rate of left ventricular short axis shorten，FS)，成模大鼠心腔扩大，FS<30%。

1.3 分组和干预

SD大鼠随机分为5组：对照组、模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组(n=10)。后3组分别以泻肺利水方药(22 g/(kg·d))、卡托普利(19 mg/(kg·d))和地高辛(32 μg/(kg·d))灌胃，对照组和模型组灌以1 ml/100 g蒸馏水灌胃，每天1次，连续35 d。

1.4 大鼠心脏功能检测

干预前后采用腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)和地西泮(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，胸前剃毛，仰卧位固定于木板上，应用心脏超声仪，分别测量左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)和左室收缩末期容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)等，计算心输出量(cardiac output，CO)和左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)。

1.5 ELISA法检测血浆BNP水平

处死大鼠时腹主动脉取血，肝素抗凝，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，取上清-20℃冰箱保存，按试剂盒说明书进行操作。

1.6 定磷法测定SERCA2a活性

心肌组织冰水浴机械匀浆，2 500 r/min离心10 min；酶标板加入去离子水、标准溶液和相应浓度蛋白液体；样品稀释20倍，取25 μl置于酶标板中，根据样品及标准品数量，按50∶1配制BCA工作液；各孔加入200 μl BCA工作液，振荡器上振荡30 s，37℃放置30 min，于570 nm处读取吸光值。以蛋白浓度(mg/ml)为纵坐标，吸光值为横坐标，绘出标准曲线，根据所测样品的吸光值及标准曲线回归方程得到相应的样品浓度。超微量Ca2+-ATP酶检测试剂加样品混匀，37℃水浴反应10 min，3 500 r/min离心10 min，取上清、双蒸水和0.02 μmol/ml磷标准液各150 μl、定磷剂应用液500 μl混匀，室温静止2 min，加终止剂500 μl混匀，室温静置5 min，波长636 nm，光径0.5 cm，双蒸水调零，测定各管吸光值。计算公式：

1.7 RT-qPCR检测大鼠心肌SERCA2a mRNA和miR-25-3p/5p表达水平

取心肌组织100 mg在液氮中充分研磨，加入1 ml Trizol，震荡混匀室温放置5 min；加入0.2 ml氯仿，剧烈震荡15 s，静置3 min；4℃ 12 000 r/min离心10 min；加入等体积异丙醇，混匀，静置20 min；4℃ 12 000 r/min离心10 min，去上清；1 ml 75% DEPC酒精洗涤沉淀；4℃ 12 000 r/min离心5 min，弃去液体；室温晾干，30 μl DEPC ddH2O溶解RNA，抽样鉴定后于-80℃冻存备用。以1 μg总RNA为模板，配制Bestar qPCR RT Kit逆转录反应体系：1 μg总RNA，Primer Mix 1.0，DEPC H2O，65℃ 5 min，冰上急冷；5x RT Buffer 4.0，RT Enzyme Mix 1.0，DEPC H2O 4.0，总体系为20 μl，37℃,60 min；98℃,10 min，合成cDNA第1链。Real time PCR 扩增的反应体系为20 μl(DBI BestarSybrGreen qPCRmasterMix)：BestarSybrGreen qPCRmasterMix10 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μl，cDNA模板1 μl，ddH2O 8 μl。PCR反应条件：逆转录94℃灭活逆转录酶及预变性2 min，94℃变性20 s，58℃退火20 s，72℃ 延伸20 s，PCR 扩增40循环。融解曲线分析：温度62℃～95℃。用Agilent Stratagene荧光定量PCR仪Mx3000P进行荧光定量PCR。反应完成后计算机自动分析Ct 值，采用2-ΔΔCt方法计算相对比值。SERCA2a和miR-25-3p/5p分别以β-actin和U6作为内参，其引物见表1。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠造模结果

对照组有9只大鼠成功采集数据。模型组、中药组、卡托普利组和地高辛组各有8、9、8、7只大鼠成功造模。成模大鼠出现食欲减退、精神较差、张口呼吸和乏力等症状，CO和LVEF无显著差异，均明显低于对照组(P<0.01，表2)；其平均体重分别为368.9±27.5、373.6±22.7、371.8±21.6和381.2±21.3(g)，组间无显著差异，均明显低于对照组g(P<0.01)。

2.2 心脏功能指标

干预后，模型组大鼠CO与LVEF明显低于对照组(P<0.01)，中药组、卡托普利组和地高辛组大组CO明显高于模型组(P<0.01)，中药组LVEF明显高于模型组(P<0.05)；中药组与卡托普利和地高辛组比较无明显差异。干预后中药组CO和LVEF明显高于干预前(P<0.05，P<0.01)，地高辛组LVEF明显高于干预前(P<0.05，表2)。

Tab. 1 Primers for RT-PCR

Tab. 2 Indices of cardiac function and plasma level of ±s)

CO: Cardiac output; LVEF: Left ventricular ejection fraction; BNP: Brain natriuretic peptide; TCM: Traditional Chinese Medicine

**P<0.01vscontrol group；?#P<0.05，##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05，△△P<0.01vsbefore treatment

2.3 血浆BNP水平

模型组血浆BNP水平显著高于对照组(P<0.01)，中药组、卡托普利组和地高辛组血浆BNP水平显著低于模型组(P<0.01)，中药组与卡托普利组和地高辛组比较无明显差异(表2)。上述变化提示泻肺利水中药、卡托普利和地高辛均能降低血浆BNP水平。

2.4 心肌细胞SERCA2a活性

模型组心肌细胞SERCA2a活性显著低于对照组(P<0.01)，中药组SERCA2a活性显著高于模型组、卡托普利组和地高辛组(P<0.05，表3)。上述变化提示泻肺利水中药提高SERCA2a活性，卡托普利和地高辛作用不明显。

2.5 RT-qPCR结果

模型组SERCA2a mRNA水平明显低于对照组，miR-25-3p 和miR-25-5p水平明显高于对照组(P<0.01)。中药组、卡托普利组和地高辛组SERCA2a mRNA水平明显高于模型组(P<0.05，P<0.01)。中药组和卡托普利组miR-25-3p 和miR-25-5p水平明显低于模型组(P<0.05，P<0.01)。中药组SERCA2a mRNA水平明显高于地高辛组，miR-25-5p水平明显低于地高辛组(P<0.05)。各组miR-25-5p的表达水平均高于miR-25-3p(P<0.01，图1，表3)。上述变化提示泻肺利水中药和卡托普利均能提高SERCA2a mRNA水平，降低miR-25-3p 和miR-25-5p水平。

3 讨论

兴奋-收缩耦联是心肌收缩和舒张的基础，Ca2+在心肌细胞兴奋-收缩耦联中起着关键作用。心肌细胞兴奋，细胞膜上的电压依赖性L-型钙通道开放，细胞外少量Ca2+内流，触发肌浆网兰尼碱受体通道在短时间内释放大量的Ca2+，胞浆Ca2+浓度瞬时大幅升高，Ca2+与肌钙蛋白结合，心肌收缩。当心肌细胞复极化时，胞浆中的Ca2+主要由SERCA2a重摄入肌浆网内，部分Ca2+通过细胞膜上的钠-钙交换体转移出细胞外，胞浆Ca2+浓度下降，Ca2+与肌钙蛋白解离，心肌舒张。心力衰竭的最基本机制是心肌细胞的兴奋-收缩耦联障碍，心肌收缩和/或舒张功能受损。衰竭心脏SERCA2a的活性或含量下降使肌浆网摄取Ca2+减少，胞浆中Ca2+浓度下降速度和幅度不足，心肌舒张延缓且不够充分；肌浆网的Ca2+储存量减少，心肌收缩时释放的Ca2+减少，心肌收缩功能下降。研究表明，SERCA2a具有正性肌力和正性变舒张效应，能够提高心肌收缩力和改善舒张功能，过表达SERCA2a可以改善心功能[4]。CUPID研究[9]发现通过腺相关病毒将SERCA2a相关基因转入患者体内，可以改善重度收缩期心衰患者的症状，降低死亡率和心衰相关住院率，减少心衰加重情况，但CUPIDⅡb研究未能取得预期的临床效果[10]。

Fig. 1 Expression of SERCA2a mRNA, miR-25-3p/5p in myocardium of rats

GroupnSERCA2amRNAmiR-25-3pmiR-25-5pSERCA2aactivity(U/mgprot)Control90.60±0.210.90±0.152.14±0.80▲▲0.103±0.048Model80.31±0.08**1.45±0.23**3.56±1.35**▲▲0.032±0.019**TCM90.56±0.20##1.11±0.21#2.16±1.24##▲▲0.073±0.046#Capto-pril80.51±0.24△1.14±0.32#2.65±0.93#▲▲0.043±0.024△Digoxin70.44±0.18△1.28±0.412.92±1.06△▲▲0.039±0.022△

SERCA2α: Sarcoplasmic reticulum ATPase 2α

**P<0.01vscontrol group；?#P<0.05，##P<0.01vsmodel group；?△P<0.05vsTCM group；?▲▲P<0.01vsmiR-25-3p

微小RNA(microRNA，miRNA)是由18～24个核苷酸构成的单链非编码RNA，调节胚胎发育、组织分化、细胞增殖、凋亡、血管生成和代谢等多种生物学过程。miRNA主要通过抑制蛋白质翻译或mRNA降解调控基因表达[5,11]。Wahlquist[5]指出：miR-25通过作用于SERCA2a mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)的靶基因mRNA结合位点而抑制SERCA2a的翻译。本实验结果提示：衰竭心脏中SERCA2a mRNA水平降低，miR-25-3p和miR-25-5p水平升高；在miR-25-3p和miR-25-5p表达受抑制的衰竭心脏中，SERCA2a mRNA水平升高，实验动物的心功能得到改善，这可能与miR-25-3p和/或miR-25-5p抑制SERCA2a mRNA降解相关。本实验中，泻肺利水方药、卡托普利和地高辛均能提高SERCA2a mRNA水平；泻肺利水中药能降低miR-25-3p和miR-25-5p的表达，提高SERCA2a的活性，这与SERCA2a表达增加有关。miR-25-3p有与miR-25相同的3'末端序列，也可能与SERCA2a mRNA的3'-UTR的结合位点结合而抑制SERCA2a的翻译，抑制miR-25-3p可以提高SERCA2a的表达水平和活性。卡托普利和地高辛不能提高SERCA2a的活性。泻肺利水方药能提高CO和LVEF，显示其均能增加心肌收缩力、改善心功能，这些作用与SERCA2a的活性提高相关。miR-25-3p和miR-25-5p均为miR-25前体的产物，分别从miR-25前体的5'端臂和3'端臂加工而来的。本实验中，miR-25-3p和miR-25-5p的趋势是一致的，miR-25-5p水平显著高于miR-25-3p的具体机制尚不清楚，可能两者升高和回落有时间差，或者大量的miR-25-3p作用于SERCA2a mRNA的3'-UTR从而导致其可检测量降低。

中医认为，慢性心衰主要表现为呼吸困难、气喘咳嗽和水肿等,辩证属水气上凌心肺，治法当“从肺论治”，泻肺利水，以恢复肺主气司呼吸、主宣发肃降、肺朝百脉主治节以通调水道之功能。泻肺利水方中葶苈子泻肺平喘、利水消肿，黄芪补气利尿消肿，杏仁平喘，陈皮理气化痰，茯苓利水化痰宁心，三菱破血行气，大枣补中益气、养血安神兼制葶苈子毒性，全方组合共奏通肺行水之功[12]。本实验证明该中药能抑制miR-25-3p/5p表达，提高SERCA2a表达水平和活性，改善心功能。本实验动物样本量少，只针对阿霉素诱导的心衰大鼠模型，泻肺利水方药治疗CHF的分子机制有待大规模的动物实验和临床试验进一步验证。

[1] Braunwald E. The war against heart failure: the Lancet lecture [J].Lancet, 2015, 385(9970): 812-824.

[2] Burchfield JS, Xie M, Hill JA. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2[J].Circulation， 2013, 128(4): 388-400.

[3] 白晓洁， 郝峻涛， 封启龙. E4031对慢性心衰大鼠离体心脏功能和心肌细胞内静息Ca2+水平的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2014， 30(4): 364-367.

[4] Kho C, Lee A, Hajjar RJ.Altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling-targets for heartfailure therapy[J].NatRevCardiol, 2012, 9(12): 717-733.

[5] Wahlquist C, Jeong D, Rojas-Munoz A,etal. Inhibition ofmiR-25 improves cardiac contractility in the failing heart[J].Nature， 2014， 508(7497): 531-535.

[6] 苏志远， 叶小汉， 吴锦波. 心康方治疗慢性心力衰竭临床观察[J]. 新中医， 2016， 48(3): 12-14.

[7] 中华医学会心血管病学分会， 中华心血管病杂志编辑委员会． 中国心力衰竭诊断和治疗指南2014[J]． 中华心血管病杂志， 2014， 42(2): 98-122．

[8] 白 剑， 顾 蓉， 王丙剑， 等． 过表达整合素连接激酶可改善慢性心力衰竭大鼠心功能[J]． 中华心血管病杂志， 2014， 42(3)： 225-229．

[9] Zsebo K, Yaroshinsky A, Rudy JJ,etal. Long-term effects of AAV1/SERCA2a gene transfer in patients with severe heart failure: analysis of recurrent cardiovascular events and mortality[J].CircRes, 2014, 114(1): 101-108.

[10]Greenberg B, Butler J, Felker GM,etal. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in patients with cardiac disease (CUPID 2): a randomised, multinational, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial[J].Lancet, 2016, 387(10024)： 1178-1186.

[11]Alsaleh G， Gottenberg JE． Characterization of microRNAs and their targets[J]．MethodsMolBiol， 2014， 1142： 55-63．

[12]吴锦波， 叶小汉， 冼绍祥， 等. 从肺论治心力衰竭大鼠左室心肌的重构[J]. 新中医， 2016， 48(7): 278-282.

Expressions of SERCA2a and miR-25-3p/5p in myocardium of rats with heart failure and therapeutic effects of Xiefei Lishui recipe

WU Jin-bo1，2, YE Xiao-han2, XIAN Shao-xiang3△, DONG Ming-guo2

(1. Post-doctoral Research Station of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510405;2. Department of Cardiology, Dongguan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Dongguan 523000;3. Department of Cardiology, the First Clinical Medical Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510405， China)

Objective: To investigate the expressions of sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA2a) mRNA and miR-25-3p/5p in myocardium of rats with heart failure and the therapeutic effects of Xiefei Lishui recipe(Traditional Chinese Medicine). Methods: SD rats were randomly divided into five groups: control group, model group, Traditional Chinese Medicine group(TCM group), captopril group and digoxin group(n=10). Heart failure rat model was induced by intraperitoneal injections of doxorubicin(6 injections within 2 weeks; total dose:15 mg/kg). Five weeks after the first injection, Distilled water(10 ml/(kg·d)), TCM(22 g/(kg·d)), captopril(19 mg/(kg·d))，and digoxin(32 μg/(kg·d))were administrated by gastrogavage for 35 days，respectively. Myocardial expressions of SERCA2a mRNA and miR-25-3p/5p were detected;myocardial activities of SERCA2a were measured; cardiac output(CO) and left ventricular ejection fraction(LVEF) and plasma level of B-type natriuretic peptide (BNP) were measured. Results: Myocardial mRNA expression of SERCA2a was significantly down-regulated in rats with heart failure which could be significantly up-regulated by TCM or captopril or digoxin，while expressions of miR-25-3p and miR-25-5p in myocardium were significantly up-regulated which could be significantly down-regulated by TCM or captopril. SERCA2a activity, CO and LVEF in rats with heart failure were decreased significantly which could be significantly increased by TCM，while plasma level of BNP was increased significantly which could be significantly decreased by TCM or captopril or digoxin. CO in rats with heart failure could be significantly increased by captopril or digoxin. Conclusion: In rats with heart failure, myocardial mRNA expression of SERCA2a was downregulated, expression of miR-25-3p and miR-25-5p in myocardium was upregulated. Xiefei Lishui recipecan upregulate myocardial mRNA expression of SERCA2a, downregulate expression of miR-25-3p and miR-25-5p in myocardium and improve cardiac function.

Xiefei Lishui recipe； heart failure, congestive； sarcoplasmic reticulum calcium ATPase； miRNA-25; mouse

2016-04-19

2016-11-21

R541.6;R289

A

1000-6834(2017)02-146-05

△【通讯作者】Tel: 020-36598909; E-mail： shaoxiangx@hotmail.com