3种模拟中医体征的体虚便秘大鼠模型建立及效果观察*

杜丽东， 任 远△， 牛亭惠， 吴国泰， 王志旺， 刘五州， 邵 晶

(1. 甘肃中医药大学， 兰州 730000； 2. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000)

3种模拟中医体征的体虚便秘大鼠模型建立及效果观察*

杜丽东1，2， 任 远1，2△， 牛亭惠1， 吴国泰1，2， 王志旺1，2， 刘五州1， 邵 晶1，2

(1. 甘肃中医药大学， 兰州 730000； 2. 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000)

目的：分别建立大鼠血虚、阴虚和阳虚便秘模型并比较其结肠动力、结肠水代谢、结肠黏液分泌和结肠水通道蛋白2(AQP2) 的表达水平。方法:40只SD大鼠，雌雄各半，随机分为4组(n=10)：正常对照组(N)、血虚便秘组(XC)、阴虚便秘组(YC)、阳虚便秘组(YAC)。分别采用放血+洛哌丁胺、甲状腺素+洛哌丁胺、冰水刺激+洛哌丁胺建立血虚便秘、阴虚便秘、阳虚便秘大鼠模型，放血每周1次，药物每天灌胃1次，连续42 d。检测大鼠活动状态、体质量、大便性状、口肛传输时间、小肠推进率、粪便和结肠含水量等体征指标，对结肠组织进行AB-PAS染色和免疫组化染色，观察黏液分泌情况和AQP2表达水平。结果：与正常对照组比较，3种模型大鼠体重增长减慢；造模第40 天自主活动量变化率由大到小依次为YC、XC和YAC；造模第30 天出现固体硬质粪便，粪便评分升高顺序为XC、YC和YAC；口肛传输时间均显著延长、小肠推进率均显著降低(P<0.05，P<0.01)，肠动力减低顺序为YC、YAC和XC；粪便含水量均显著减少(P<0.05，P<0.01)，XC和YAC组大鼠结肠含水量显著减少(P<0.05，P<0.01)，YC大鼠结肠含水量有减少趋势，结肠水代谢顺序为YC、YAC和XC；3种模型大鼠结肠黏膜层腺管和杯状细胞出现不同程度缩小，黏液分泌减少，分泌功能障碍顺序为YAC、YC和XC，且近端和远端结肠AQP2的表达均显著增加(P<0.05，P<0.01)，增加顺序近端结肠为YAC、YC、XC，远端结肠为YAC、XC和YC。结论：复合因素长期刺激均可建立符合中医体征的便秘大鼠模型，且各模型大鼠结肠运动、结肠水代谢、结肠黏液分泌和AQP2表达水平存在一定的差异。

便秘模型；肠动力、结肠水代谢、结肠黏液分泌；水通道蛋白2 (AQP2)

【DOI】 10.12047/j.cjap.5479.2017.036

便秘是多种原因引起临床常见疾病，也是许多疾病的临床症状之一，严重影响患者的生活质量。中医临床将便秘分为实秘(包括热秘、气秘、冷秘)和虚秘(包括血虚秘、阴虚秘、阳虚秘)，其中虚秘居多[1]。目前，便秘动物模型的研究分别依据现代医学理论和中医理论进行探索性复制，多采用洛哌丁胺、复方地芬诺酯、大黄、小檗碱、硫糖铝、吗啡等具有抑制胃肠运动的药物导致粪便干涩、排出困难建立基于现代医学理论的便秘动物模型；依据中医理论建立的便秘动物模型有失水燥结型、冰水寒积型、实热型、阴虚血瘀型、脾虚型和血虚型等[2]。便秘动物模型建立方法多样，但模型制作使用药物、制作周期不一，模型成功判断缺乏深度，符合中医虚症研究多集中在疗效观察。本研究采用主要致病因素(慢性失血、甲状腺素、冰水刺激)联合胃肠动力抑制剂洛哌丁胺复制血虚便秘、阴虚便秘、阳虚便秘大鼠模型，并比较其结肠运动、结肠水代谢、结肠黏液分泌和结肠水通道蛋白2(aquaporin-2，AQP2)表达水平的差异，为探索符合中医体征的体虚便秘动物模型研究和相关润肠通便中医药药效学研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

盐酸洛哌丁胺胶囊，批号：150623441，西安杨森制药有限公司生产；过碘酸-雪夫(AB-PAS)染色试剂盒，批号：20150928，北京索莱宝科技有限公司生产；水通道蛋白2(AQP2)免疫组化试剂盒，批号：D-B1-07C17B，北京博奥森生物技术有限公司生产；水合氯醛，批号：20150120，天津市致远化学试剂有限公司生产。

1.2 主要仪器

AU5400型全自动生化分析仪(日本Olympus)，BX51-32H01型显微镜(日本Olympus)，DL-5M型台式离心机(湖南新科科学仪器有限公司)，BS110型电子天平(德国 Sartorius)。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(180±20) g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，合格

证号SCXK(甘)2011-0004。自由摄食、饮水，喂食标准饲料(由甘肃中医药大学实验动物中心提供)；饲养温度：20～24℃，相对湿度：50%～60%。

1.4 分组、造模及给药

SD大鼠40只，雌雄各半，适应性饲养3 d后，按性别体重随机分为正常对照组、血虚便秘组、阴虚便秘组、阳虚便秘组，共4组，每组10只，单笼饲养。参照文献[3-6]方法，血虚便秘组大鼠分别于造模第1、8、15 天用75%酒精擦拭尾部使血管充血，剪去尾尖0.2～0.3 cm，将伤口浸入40℃温水中，使大鼠失血约2 ml，第22、29、36 天眼眶静脉丛放血，每次约2 ml；阴虚便秘组大鼠灌胃甲状腺素片混悬液20 mg/kg；阳虚便秘组大鼠灌胃0℃生理盐水20 ml/kg，各造模大鼠均灌胃洛哌丁胺10 mg/kg，正常对照组大鼠灌胃等容量生理盐水，给药容积10 mg/kg，每天1次，连续42 d。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 一般状态 实验期间观察各组大鼠活动、精神状态、毛色、粪便数量和形状、尿量和尿液颜色。

1.5.2 体质量 分别在造模前和造模第10、20、30、40天称体质量，计算每10 d的体质量变化量，判断各组大鼠体重增长趋势。

1.5.3 自主运动量[7]自制敞箱(高60 cm，长50 cm，宽80 cm，周壁为黑色，白色地面用黑线划分为12 cm×12 cm的方块)，在黑暗的、安静的房间进行。敞箱中央上方1 m处悬挂1个100 W灯泡。造模第10、20、30、40 天将每只大鼠置于敞箱的中央，以大鼠5 min内穿越地面方块数作为水平运动得分，以5 min内直立次数为垂直运动得分，水平运动得分加垂直运动得分表示大鼠的运动量，每只大鼠测定一次。

1.5.4 排便评分 分别在造模前和造模第10、20、30、40 天，在直径60 cm的圆盆中盛满水(水温10±1 ℃)，水中央放置直径10 cm的柱形平台，平台面高出水面约1 cm，将各组大鼠置于平台上，观察每只大鼠2 h 内排便情况，定形粪便记录粒数，不定形或稀便记录排便次数；并累积记录各大鼠2 h内粪便的评分。泄泻稀便计0分，软便不定形计1分，软便定形计2分，固体定形计3分。

1.5.5 肠运动功能和结肠水代谢功能 第40天给药1 h后(事先已禁食不禁水12 h)，各组大鼠灌胃5%炭末糊2.0 ml/只，记录每只大鼠首粒黑便排出时间；并收集给炭末糊后12 h内粪便，记录粒数，称湿重，60℃恒温干燥箱干燥12 h，称干重，计算粪便含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。第42天给药

1 h后(事先已禁食不禁水12 h)，各组大鼠灌胃5%炭末糊2.0 ml/只，30 min后颈椎脱臼处死各组大鼠，开腹，取出小肠，分离系膜，铺直，测量小肠全长(幽门至回盲部距离)及推进距离(幽门至炭末前沿的距离)，计算小肠推进率=炭末推进距离/小肠全长×100%。取结肠组织(距盲肠6 cm处)2 cm，称湿重，60℃恒温干燥箱干燥12 h，称干重，计算结肠含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5.6 结肠黏液分泌功能 取结肠组织(距盲肠4 cm处)2 cm，Carnoy氏固定液(无水乙醇60 ml，冰醋酸10 ml，氯仿30 ml)，石蜡包埋，常规切片，AB-PAS染色，200倍光镜下观察结肠黏液分泌情况。

1.5.7 结肠AQP2表达水平 分别取各组大鼠近端结肠组织(距盲肠2 cm处)和远端结肠组织(距肛门2 cm处)2 cm，10%甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，免疫组化染色，400倍光镜下观察阳性染色情况，使用成都泰盟BI-2000医学图象分析系统，计算阳性信号的平均积分光密度(integrated optical density，IOD)和平均光密度(optical density，OD)。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 一般状态

正常对照组大鼠反应灵敏，皮毛光泽较好，粪便形状规则，质稍硬，互不黏连，与正常对照组比较，血虚便秘大鼠均出现蜷缩，喜卧，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳廓、鼻唇苍白；阴虚便秘大鼠躁动不安，多动好斗，竖毛、皮毛光泽度差，尿液颜色较深；阳虚便秘大鼠蜷缩，萎靡，体毛枯疏，光泽度差，尿量增多。3种体虚便秘大鼠在20 d后粪便逐渐成形变硬。

2.2 造模对大鼠体质量增长的影响

造模前、造模20 d各组大鼠体重增长无差异，随着造模时间延长，各造模组大鼠体重增长减慢，与正常对照组比较，造模第30 天，血虚便秘组和阴虚便秘组大鼠体重增长显著减慢(P<0.05)，造模第40 天，3种体虚便秘模型大鼠体重增长均显著减慢(P<0.05，P<0.01，表1)。

2.3 造模对大鼠自主活动量的影响

与正常对照组比较，血虚便秘组大鼠造模20 d后自主活动量开始减少，第40 天差异具有统计学意义(P<0.05)；阴虚便秘组大鼠随着造模周期延长，自主活动量逐渐增多，第30、40 天显著增多(P<0.05，P<0.01)；阳虚便秘组随着造模周期延长，自主活动量有减少趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，第40天自主活动量变化率由大到小依次为阴虚便秘组、血虚便秘组和阳虚便秘组(表2)。

2.4 造模对大鼠大便评分的影响

与正常对照组比较，3组造模大鼠在造模10、20 d均出现稀便，粪便总评分明显降低(P<0.05，P<0.01)，造模第30 天粪便逐渐成形，出现定形软便和固体粪便，造模第40天为固体定形粪便；与造模第10、20 天比较，粪便评分升高，但与正常对照组比较，差异无统计学意义(表3)。

Tab. 1 The comparison of body weight in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab. 2 The comparison of autonomic activities in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab. 3 The comparison of total feces scores of stool characteristics in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.5 造模对大鼠肠运动功能和结肠水代谢功能的影响

与正常对照组比较，血虚便秘组、阴虚便秘组和阳虚便秘组大鼠口肛传输时间均显著延长、小肠推进率均显著降低 (P<0.05，P<0.01)；肠动力减慢顺序依次为阴虚便秘组、阳虚便秘组、血虚便秘组。3种模型大鼠粪便含水量均显著减少(P<0.01)，血虚便秘组和阳虚便秘组大鼠结肠含水量显著减少(P<0.05，P<0.01)，阴虚便秘组大鼠结肠含水量有减少趋势，但差异无统计学意义；结肠水代谢功能降低顺序依次为阴虚便秘组、阳虚便秘组、血虚便秘组(表4)。

Tab. 4 The comparison of intestinal transport and water metabolism in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.6 造模对大鼠结肠黏液分泌的影响

大鼠结肠黏膜层可见AB或PAS染色阳性的黏液，杯状细胞呈空泡状，胞质内和大肠腺腺腔内的酸性黏液显蓝色，中性黏液显红色，混合黏液显紫色。正常大鼠结肠黏膜层上皮细胞和杯状细胞形态饱满、圆润，黏液分泌丰富，黏膜表面覆盖有混合性黏液；血虚便秘组、阴虚便秘组和阳虚便秘组大鼠黏膜层上皮细胞和杯状细胞出现不同程度缩小，黏液分泌减少，黏膜表面黏液覆盖减少或者无黏液覆盖(图1)。

Fig. 1 The comparison of colon mucus secretion in rats (AB-PAS staining，×20) A: Normal control group； B: Xue-Xu with constipation group； C: Yin-Xu with constipation group； D: Yang-Xu with constipation group

2.7 结肠AQP2表达

近端和远端结肠粘膜上皮细胞胞质和胞膜上均有AQP2阳性表达。与正常对照组比较，3组模型大鼠近端和远端结肠AQP2的表达水平均增加，其中近端结肠OD和IOD值均显著增高(P<0.01)，增加顺序为阳虚便秘组、阴虚便秘组、血虚便秘组；远端结肠OD值显著增高(P<0.05，P<0.01)，IOD值增高，但差异无统计学意义(P>0.05)，增加顺序为阳虚便秘组、血虚便秘组、阴虚便秘组，远端结肠组织AQP2增加程度大于近端结肠组织(图2、3，表5)。

Fig. 2 The comparison of the levels of aquaporin-2 expression in proximal colon in rats among groups (Immunohistochemical staining ×20) A: Normal control group； B: Xue-Xu with constipation group； C: Yin-Xu with constipation group； D: Yang-Xu with constipation group

Fig. 3 The comparison of the levels of aquaporin-2 expression in distal colon in rats among groups (Immunohistochemical staining ×20) A: Normal control group； B: Xue-Xu with constipation group； C: Yin-Xu with constipation group； D: Yang-Xu with constipation group

Tab. 5 The comparison of the levels of aquaporin-2 expression in proximal and distal colon in rats among groups ±s, n=10)

N: Normal control group; XC: Xue-Xu with constipation group; YC: Yin-Xu with constipation group; YAC: Yang-Xu with constipation group

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 讨论

随着人们生活节奏日渐加快，饮食结构的改变，精神和心理因素的影响，便秘的患病率增加，且随年龄增长而升高，严重影响人们生活质量[8]。中医学认为[9-10]血虚津枯，则不能下润大肠，致大便干燥，排出不畅；下焦阴虚，则精血枯燥，津液不到而肠脏干槁；久病及肾、脾肾阳虚，肾司二便，则大便艰涩，排出困难，腹中冷痛，喜热怕冷，腰膝酸软。本研究采用复合因素复制3种虚症便秘模型，失血法符合中医血虚便秘的病因之一血的持久过度的损耗，血的滋润和营养减弱，致全身血虚，肠失濡养，使肠壁枯衰，传导乏力；甲状腺素法[11]模拟临床甲状腺功能亢进时怕热、多汗、神经过敏、急躁、震颤等类似于阴虚的现象；0℃冰水灌胃法[5]符合中医过寒伤阳的阳虚便秘中医病因理论；洛哌丁胺[6]是常用的止泻剂，主要通过阻断外周阿片受体、抑制钙调蛋白的功能和电压依赖性钙离子通道抑制肠道平滑肌收缩，减少肠道蠕动及肠液分泌, 是常用来制作便秘模型的药物。复制的血虚、阴虚、阳虚便秘动物模型分别出现蜷缩，喜卧，萎靡，皮毛膨松、易掉，耳廓、鼻唇苍白，活动减少的血虚体征；出现躁动不安，竖毛、皮毛光泽度差，尿液颜色变深、体重增长缓慢等阴虚体征；出现蜷缩，萎靡，体毛枯疏，光泽度差，尿量增多等阳虚体征；同时各组大鼠出现不同程度口肛传输时间延长，小肠推进率减慢，粪便干硬等便秘体征，同时结肠残存粪便含水量和结肠含水量减少均减少。

结肠黏膜杯状细胞分泌液富含粘蛋白，粘蛋白与水结合形成黏液，形成“黏液屏障”，此屏障对黏膜起机械性保护作用，同时黏液能够润滑黏膜表面，以利粪便运行。研究显示[12]便秘时杯状细胞萎缩，分泌黏液能力下降甚至丧失。本研究通过对结肠组织行AB-PAS染色，结果3种模型大鼠黏膜层上皮细胞和杯状细胞出现不同程度缩小，黏液分泌减少，黏膜表面黏液覆盖减少或者无黏液覆盖。

水通道蛋白是一类位于细胞膜或细胞内囊泡的能够通透水的蛋白质分子家族，广泛存在于哺乳动物的各种组织细胞中，在水的吸收、腺体的分泌和细胞内外的水平衡等方面起到重要的生理作用。近年来，随着对水通道蛋白研究的不断深入，在哺乳动物体内发现 13 种水通道蛋白(AQP0- AQP12)，而在结肠表达的AQPs亚家族至少有7种，包括：AQP1、2、3、4、5、8，9，其中AQP2在远端结肠[13-17]表达。AQPs 在便秘发病中的作用机制研究逐渐增多，许多学者认为AQPs在大肠内的异常表达或者缺失，导致结肠对水分的吸收过度和(或)肠液分泌减少参与便秘的发生。研究显示[18-19]结肠AQP2参与结肠水液调节，远端结肠AQP2表达降低时，粪便含水量增加。本研究结果显示3种体虚便秘模型大鼠近端和远端结肠AQP2含量增加，粪便干结，提示结肠AQP2表达增多，可能使结肠水分重吸收增多而黏液分泌减少。

本研究建立的血虚便秘大鼠模型、阴虚便秘大鼠模型和阳虚便秘大鼠模型分别兼具血虚、阴虚、阳虚3种虚症和便秘的体征。模型复制方法简单可行，在目前没有更好体现中医病症结合动物模型的情况下，可作为开展虚症便秘的基础研究和开发有效治疗虚症便秘药物评价的动物模型。但该虚症便秘模型未能反映中医临床因虚致秘的因果关系，还需进一步深入研究。

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Establishment and effect observation on three kinds of Ti-Xu with constipation rat models

DU Li-dong1,2， REN Yuan1,2△, NIU Ting-Hui1， WU Guo-tai1,2， WANG Zhi-wang1,2， LIU Wu-Zhou1， SHAO Jing1,2

(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2. Gansu Province Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To establish three types constipation models with the syndrome of Xue-Xu, Yin-Xu and Yang-Xu in rats, and to compare the difference of colonic motility, colonic water metabolism, colonic mucus secretion and the level of aquaporin-2 (AQP2). Methods: Forty Sprague Dawley rats, male and female in half, were randomly divided into four groups: normal control group(N), Xue-Xu with constipation group(XC), Yin-Xu with constipation group(YC) and Yang-Xu with constipation group(YAC). Bloodletting and loperamide were used to induce the Xue-Xu with constipation in rats, thyroxin and loperamide were used to induce the Yin-Xu with constipation in rats, ice-water stimulation and loperamide were used to induce the Yang-Xu with constipation in rats. Bloodletting was coducted once a week，drug was administrated orally to rats once a day for continuous 42 days．Rats’ state, body weights, stool character, transfer time between mouth and anal, small intestinal propulsion rate were measured. The colon tissues of rats were stained with alcian blue-periodic acid schiff (AB-PAS) to analyze the changes of mucus secretion. The aquaporin-2 expressions in proximal and distal colon of rats were measured by immunohistochemical method. Results: Compared to normal control group, weight-increasing speed of the rats were reduced in three models. The order of independent movement change was YC, XC and YAC. Solid stool appeared at 30 d, fecal scores were increased. Transfer time between mouth and anal was significantly extended, small intestinal propulsion rate were significantly decreased(P<0.05，P<0.01). Water content in stool were significantly decreased in three type models(P<0.05，P<0.01), the content of water in colon were decreased in XC and YAC group (P<0.05，P<0.01). The colonic gland and goblet cells were narrowed in some extent, the mucus excretion were decreased. The levels of aquaporin-2 expressions in proximal and distal colon of rats were increased(P<0.05，P<0.01), increasing order of AQP2 expression in proximal colon was YAC, YC and XC, increasing order of AQP2 expression in distal colon was YAC, XC and YC. Conclusion: Long term stimulation of complex factors could induce Ti-Xu with constipation animal model, and there were some differences in colonic motility, water metabolism, colonic mucus secretion and AQP2 in rats.

constipation model； intestinal motility； colonic water metabolism； colonic mucus secretion； aquaporin 2 (AQP2)

甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目(ZDSYS-KJ-2015-009，ZDSYS-ZZ-2015-002)；陇原青年创新人才扶持计划项目(甘组电明字[2015]34号)；甘肃省中药现代制药工程研究院基金项目(YWW-2015050)

2016-07-25

2016-11-28

R285.5

A

1000-6834(2017)02-140-06

△【通讯作者】Tel： 0931-8762653; E-mail： Leyuan816@163.com