丁苯酞对豚鼠平喘作用的初步药效学观察*

王志旺， 王永辉， 任 远， 王瑞琼， 蔺兴遥， 段海婧

(1． 甘肃中医药大学， 兰州 730000； 2． 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000； 3． 山西中医学院， 太原 030024)

丁苯酞对豚鼠平喘作用的初步药效学观察*

王志旺1,2△， 王永辉3△， 任 远1,2△， 王瑞琼1， 蔺兴遥1， 段海婧1

(1． 甘肃中医药大学， 兰州 730000； 2． 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室， 兰州 730000； 3． 山西中医学院， 太原 030024)

目的：初步探讨丁苯酞对豚鼠的平喘作用及机制。方法：本次研究分为离体气管平滑肌实验与动物整体实验两部分。在离体实验中制备豚鼠离体气管片，使用Ach、Hist使气管平滑肌收缩达到最大值后，按累积加药法加入丁苯酞，记录1、10、100 mg/L丁苯酞对痉挛气管平滑肌的解痉作用(n=10)。在整体实验中，取经筛选的豚鼠分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组及丁苯酞高、低剂量组(n=8)，在吸入低浓度激发液(1%ACh:0.05%Hist=1:1)激发6次(每次10 s)的基础上，第7次吸入高浓度激发液(2%ACh:0.1%Hist=1:1)10 s，观测90 mg/kg、30 mg/kg丁苯酞对哮喘豚鼠行为学以及血清NO、支气管肺泡灌洗液(BALF)中ET-1的影响。结果：1、10、100 mg/L的丁苯酞对ACh、Hist引起的离体痉挛状态的豚鼠气管平滑肌有显著的解痉作用(对Ach的解痉率为15.08±7.68、42.41±13.54、77.56±24.82；对Hist的解痉率为19.40±7.60、56.84±11.72、76.35±19.40)且呈一定的量效关系(P<0.05, 0.01)；在乙酰胆碱与组胺的引喘下，90 mg/kg、30 mg/kg丁苯酞能明显延长豚鼠的哮喘潜伏期(53.3±13.2、33.1±13.0)，改善哮喘行为学，降低血清NO(78.71±19.40、84.75±20.97)、支气管肺泡灌洗液(BALF)中ET-1(24.30±5.80、28.50±6.31)的含量(P<0.05, 0.01)。结论：丁苯酞具有一定的平喘作用，而缓解NO、ET-1异常升高是其作用机制之一。

丁苯酞；平喘；豚鼠；一氧化氮；内皮素-1

【DOI】 10.12047/j.cjap.5463.2017.035

中医理论认为当归“主咳逆上气”并与其它中药配伍用于临床治疗支气管哮喘(简称哮喘)，在研究当归及其挥发油平喘、防治哮喘物质基础的过程中，我们发现当归挥发油中的丁苯酞对豚鼠气管平滑肌有解痉作用。丁苯酞是目前治疗缺血性脑卒中的药物之一[1]，是当归挥发油中性质较稳定的成分之一。本次研究以豚鼠离体气管平滑肌、在体哮喘豚鼠为研究对象，观察丁苯酞对豚鼠的平喘作用，同时测定血清一氧化氮(nitric oxide, NO)、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中的内皮素-1(endothelin-1, ET-1)，探讨丁苯酞治疗哮喘的作用及其机制。现将实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

丁苯肽(butylphthalide, BPL)，中国生物制品检验所，批号：101035-200901，用于离体实验；苯酞软胶囊(butylphthalide, BPL)，石药集团恩必普药业有限公司，批准文号：国药准字H20050299，产品批号：13040611，用于在体实验；氨茶碱(aminophylline, APH)，上海信谊金朱药业有限公司，国药准字H20033430；醋酸地塞米松片(dexamethasone, DXM)，天津药业新郑制药有限公司生产，批准文号：国药准字H41021038。取丁苯酞置研钵中，加入丁苯酞一半量的吐温-80，采用干胶法按“油∶胶∶水=2∶1∶2”的比例制备初乳，稀释后即得100 mg/L(离体实验)与0.9 g/L(在体实验)丁苯酞乳剂；另取吐温-80配制1%的空白对照液，冷藏备用。乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、磷酸组胺(histamine, Hist)，阿拉丁试剂公司，批号：40837、47835；吐温-80，上海大众制药厂，批号：700934；一氧化氮(NO)试剂盒，南京建成生物工程研究所提供，生产批号为20130203；内皮素-1(ET-1)测试盒，上海源叶生物科技有限公司，批号为20130201A。

1.2 仪器

HB-2型二道生理记录仪(成都仪器厂生产)，HU-1型肌张力换能器(淮北正华生物仪器设备有限公司产品)，HH-S型电热恒温水浴锅(江苏省医疗器械厂生产)，BS1103型Sartorius电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司产品)，420AI超声雾化器(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司生产)，CH Technologies鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系统，TGL-16G高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂生产)。

1.3 动物

豚鼠，雌雄兼用，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，实验动物质量合格证(62000600000079)。

1.4 丁苯酞对豚鼠离体气管平滑肌的解痉作用

1.4.1 豚鼠离体气管条的制备 参考气管片法[2]，取体质量250～350 g豚鼠用棒击其后脑至昏，立即刨开颈至胸部皮肤肌肉，取下从喉头至气管分叉处的完整气管段，放入Krebs-Henseleit营养液中，剥离气管外附组织，用营养液冲洗管腔内容物后将气管从软骨中线(胸侧)纵向剪开，再沿软骨走向均等剪成6段，将相间3段气管沿纵刨线缝合在一起，一端固定在L型通气小钩上，另一端固定于换能器上。将实验标本置于预先装有10 ml恒温(37±0.5℃)营养液的麦氏浴管中，每分钟通气(内含95%O2和5%CO2)约15～20个气泡。二道生理记录仪记录肌张力变化，调整气管静息张力为1 g，待气管平滑肌回复正常舒缩功能后开始实验。

1.4.2 丁苯酞对ACh引起的豚鼠离体痉挛气管平滑肌的解痉作用 首先记录气管平滑肌的正常收缩曲线，之后向麦氏浴管中加入5×102mg/L ACh 0.1 ml，等气管平滑肌收缩反应达到最大值后，按累积加药法依次加入102、103、104mg/L丁苯酞，使营养液中的丁苯酞终浓度分别达到1、10、100 mg/L，记录药物对痉挛气管平滑肌的解痉作用。每次加药间隔约10 min，等低浓度药物的作用达到平衡后再加药至高浓度，对不同气管平滑肌重复上述操作10次(n=10)，分别以氨茶碱、空白对照液为对照进行实验，按下式计算解痉率(%)。

1.5 丁苯酞对豚鼠哮喘行为学及NO、ET-1的影响

1.5.1 筛选、分组 参考整体动物引喘法[3,4]，将体质量120～160 g的健康豚鼠(雌雄兼用)放入吸入染毒系统，以2 ml/min的雾化速度使豚鼠吸入激发液(2%ACh与0.1%Hist按1∶1的比例混合)10 s，观察豚鼠出现哮喘发作(呼吸频率、呼吸幅度与点头呼吸三者中至少出现1项较明显的变化)的时间即为引喘潜伏期，超过120 s仍无反应者弃之不用。将筛选合格的豚鼠按性别体质量分层随机分为5组(n=8)：即正常对照组(Control)、模型对照组(Model)、地塞米松组(DXM, 1 mg/kg)、丁苯酞高(BPLH, 90 mg/kg)、低剂量组(BPLL, 30 mg/kg)。

1.5.2 造模给药、测定指标 上述各组动物按10 ml/kg灌胃给药，其中正常对照组与模型对照组灌胃等量空白对照液，每天1次，连续7 d。给药1 h后，按筛选动物的方法让豚鼠吸入低浓度激发液(1%ACh与0.05%Hist按1∶1混合)10 s，其中正常对照组以生理盐水代替激发，每天1次，连续6 d。第7天给药1 h后，让豚鼠吸入高浓度激发液(2%ACh与0.1%Hist按1∶1混合)10 s，其中正常对照组以生理盐水代替，观测从激发开始6 min内豚鼠哮喘行为学并评分：呼吸频率与幅度正常，未出现异常情况者计0分；呼吸频率与幅度正常，仅出现轻微点头呼吸者计1分；呼吸频率正常，幅度较大，点头呼吸明显者计2分；呼吸频率加快，幅度加大，点头呼吸甚至跌倒者计3分[5]。从激发到动物出现呼吸等异常情况的时间为哮喘潜伏期，超过6 min仍无任何症状者哮喘潜伏期按6 min计算。第7次激发24 h后，戊巴比妥麻醉，眼眶采血，离心后取血清按试剂盒说明书测定NO；脱颈椎处死动物后手术暴露气管，提取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，离心后取上清液按试剂盒说明书测定ET-1。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 丁苯酞对Ach、Hist引起豚鼠离体痉挛气管平滑肌的解痉作用

与正常对照组比较，1～100 mg/L浓度范围内的丁苯酞对ACh、Hist引起的离体痉挛状态的豚鼠气管平滑肌有显著的解痉作用，且其解痉作用有明显的量效关系(P<0.01，图1、图2)。

Fig. 1 Antispasmodic effect of BPL on spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pigs motivated by ACh (n=10) APH: Aminophylline; BPL: Butylphthalide; Ach: Acetylcholine*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vsmedium concentration (10 mg/L) group

2.2 丁苯酞对豚鼠引喘潜伏期及哮喘行为学的影响

在激发过程中，模型对照组豚鼠普遍出现呼吸频率加快、幅度加大、点头呼吸、部分跌倒甚至死亡；与正常对照组比较，引喘潜伏期和哮喘行为学有统计学意义(P<0.01)。经丁苯酞防治后，引喘潜伏期和哮喘行为学得到不同程度的缓解，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01，表1、表2)。

Fig. 2 Antispasmodic effect of BPL on spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pigs motivated by Hist (n=10) APH: Aminophylline; BPL: Butylphthalide; Hist: Histamine*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vsmedium concentration (10 mg/L) group

GroupAsthmaticincubationperiod(s)Pre-dosePost-doseExtendedtimeControl52.8±7.6360.0±0.0307.3±7.6Model54.8±8.163.5±7.0**8.8±6.5**DXM52.9±7.1127.4±25.2##74.5±20.1##BPLH52.5±8.8105.8±20.2##△△53.3±13.2##△△BPLL51.9±8.985.0±15.8##33.1±13.0##

DXM: Dexamethasone; BPLH: Butylphthalide high-dose group; BPLL: Butylphthalide low-dose group

**P<0.01vscontrol group;?##P<0.01vsmodel group;?△△P<0.01vsBPL low-dose group

GroupAsthmabehavior-(0)+(1)++(2)+++(3)MeanseriesRvalue95%confidenceintervalCon-trol80000.000.10±0.20Model00262.750.84±0.20**DXM05301.380.44±0.20#BPLH03501.630.52±0.20#BPLL02511.880.59±0.20

DXM: Dexamethasone; BPLH: Butylphthalide high-dose group; BPLL: Butylphthalide low-dose group

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05vsmodel group

2.3 丁苯酞对哮喘豚鼠血清NO、BALF中ET-1的影响

经过低浓度的激发液反复刺激后，除模型对照组有1只动物死亡外，其余动物顺利完成实验。经过激发液的反复刺激，豚鼠血清NO、BALF中ET-1的水平明显上升，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01)；经丁苯酞干预后，NO与ET-1的水平下降，与模型对照组比较有统计学意义(P<0.05, 0.01，表3)。

GroupnNO(μmol/L)ET-1(ng/L)Con-trol859.07±17.2920.45±5.25Model7104.55±21.96**38.76±7.76**DXM868.82±18.14##25.30±6.01##BPLH878.71±19.40#24.30±5.80##BPLL884.75±20.9728.50±6.31#

BPLH: Butylphthalide high-dose group; BPLL: Butylphthalide low-dose group; NO: Nitric oxide; BALF: Bronchoalveolar lavage fluid; ET-1: Endothelin-1; DXM: Dexamethasone

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是呼吸系统的常见病、多发病，近三十年来尽管采取包括糖皮质激素在内的综合抗炎抗过敏治疗方案，但流行病学调查发现哮喘的发病率、死亡率未随之而降低，仍需要去寻找新的方法来防治哮喘[6]。丁苯酞(又名(正)丁基苯酞、丁基酞内酯、丁基酞内酯、丁基邻苯甲酸内酯，Butylphthalide)是我国第三个拥有自主知识产权的化学药物，也是世界上用于治疗脑血管病的新药，最初是杨峻山从芹菜籽中提取的左旋体，故又名芹菜甲素，现已人工合成，化学式为C12H14O2，相对分子质量190，呈黄色油状物，有芹菜香味，目前主要用于治疗脑血管疾病。当归、川芎和藁木等中药中均含有丁苯酞，是上述中药挥发油中苯酞类成分之一。实验研究显示[7,8]，当归、川芎及其挥发油对平滑肌、特别是气管平滑肌有明显的舒张作用，临床可用于治疗哮喘；本课题组前期研究显示，当归挥发油对气管平滑肌具有明显的舒张作用[9]，而在当归挥发油平喘物质基础的探讨中展开丁苯酞平喘作用的研究。

离体实验可避免神经、体液等全身因素对实验结果的影响，直接展现药物的作用；离体气管平滑肌实验中常见的有气管片、气管环、气管螺旋片以及气管容积法等，其中气管螺旋片法中很难将气管剪成宽度相等的螺旋片，气管容积法与气管环法的系统误差比较大，而气管片法操作简单，系统误差较小[10]，故本次实验以痉挛状态的离体豚鼠气管片为研究对象，采用累积加药法观察丁苯酞的解痉作用。研究结果显示，丁苯酞对离体痉挛状态的豚鼠气管平滑肌有明显的解痉作用且呈一定的量效关系，提示丁苯酞具有舒张支气管平滑肌而平喘的潜在药理作用。

整体实验较离体实验更能反映药物对生物体的实际药理作用；豚鼠整体引喘法曾经是研究平喘药物的经典实验方法，但是由于豚鼠对乙酰胆碱、组胺等引喘物质的敏感性非常高，实验过程中动物的死亡率较高而限制了本实验的开展。本次实验首先采用较高浓度的激发液对豚鼠进行筛选，对实验纳入动物通过低浓度激发液的反复刺激，提高豚鼠对激发液的耐受性而降低死亡率，最后在高浓度激发液的刺激下观察豚鼠的哮喘行为学。实验结果显示，丁苯酞对豚鼠引喘潜伏期以及呼吸频率、幅度等哮喘行为学指标有明显的缓解作用。

一氧化氮(NO)与内皮素(endothelin, ET)是调节平滑肌舒缩功能的重要活性物质，广泛参与支气管哮喘中的气道高反应性、呼吸道炎症、黏液高分泌及气道重塑等病理反应过程。NO是L-精氨酸在NO合成酶的催化下裂解生成，近年来研究认为，在哮喘的发病机制中NO具有双相调节作用，低浓度时可引起支气管平滑肌松弛与血管舒张效应，但在较高浓度时，NO则显示出一定的毒性作用，它可引起毛细血管后静脉扩张而促进渗出、支气管上皮细胞肿胀脱落而加重气道的炎症反应，炎症反应提高气道反应性而加重哮喘症状[11]。ET是由21个氨基酸残基构成的活性多肽，有3种亚型(ET-1～3)，其中ET-1是目前最强烈的血管、支气管平滑肌收缩剂；同时ET-1还具有刺激平滑肌细胞和成纤维细胞增殖作用而参与气道重构，促进粘膜下腺体分泌而提高痰液的粘稠度，诱导前列腺素、组胺及血小板活化因子等炎性介质释放而加重气道炎症，提高气道的反应性。因此，ET-1既是哮喘发生的始动因子，也是哮喘的效应分子，其表达水平与哮喘的严重程度成正比[12,13]。在本次实验中，采用组胺与乙酰胆碱反复激发来诱发哮喘，结果显示哮喘豚鼠血清NO与BALF中ET-1明显上升，在丁苯酞的干预下上述异常变化得到不同程度的缓解，提示调节NO、ET水平是丁苯酞平喘作用机制之一。

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Preliminary pharmacodynamics study on antiasthmatic action of butylphthalide in guinea pig

WANG Zhi-wang1,2△, WANG Yong-hui3△, REN Yuan1,2△, WANG Rui-qiong1,LIN Xing-yao1, DUAN Hai-jing1

(1． Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000; 2． Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for Traditional Chinese Medicine of Gansu Province, Lanzhou 730000; 3．Shanxi College of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan 030024, China)

Objective: To study the anti-asthmatic effects of butylphthalide in guinea pig. Methods: This research included isolated tracheal smooth muscle andinvivoanimal experiments. Antispasmodic effects of butylphthalide at the concentrations of 1, 10, 100 mg/L were observed through spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pig induced by acetylcholine or histamine (n=10). After screened, the guinea pigs were divided into control group, model group, dexamethasone(DXM) group, high and low dose butylphthalide groups. The effects of butylphthalide on nitric oxide (NO), endothelin-1 (ET-1) and asthmatic behaviors were observed on the asthmatic guinea pigs that were stimulated six times by the excitation fluid (1%ACh:0.05%Hist=1:1). Results: Butylphthalide at the concentrations of 1、10、100 mg/L had anti-spasmodic effects on spasmodical tracheal smooth muscle of guinea pig (15.08±7.68、42.41±13.54、77.56±24.82 to acetylcholine, 19.40±7.60、56.84±11.72、76.35±19.40 to histamine), which showed a certain dose-effect relationship. Butylphthalide could prolong asthmatic incubation period (53.3±13.2、33.1±13.0), improve asthmatic behaviors, reduce NO in serum (78.71±19.40、84.75±20.97) and ET-1 in bronchoalveolar lavage fluid (24.30±5.80、28.50±6.31) (P<0.05, 0.01). Conclusion: Butylphthalide has some effects of anti-asthma and one of the mechanisms is to relieve abnormal increase of NO and ET-1.

butylphthalide (BPL); antiasthma; guinea pig; nitric oxide (NO); endothelin-1 (ET-1)

国家自然科学基金项目(81460668)；甘肃省自然科学基金项目(1310RJZA086, 1606RJZA011)；甘肃省中药药理与毒理学重点实验室开放基金项目(ZDSYS-KJ-2015-002, ZDSYS-KJ-2016-004)

2016-06-13

2016-11-27

R562.25；R285.5

A

1000-6834(2017)02-136-05

△【通讯作者】Tel: 0931-8765395; E-mail: wzw0933@126.com, wyh766188@sina.com, leyuan988@163.com