微小RNA-155在系统性红斑狼疮外周血单个核细胞中的表达

李 莉，李淑敏，张志涛，王卫远

(1.邯郸市传染病医院 检验一科，河北 邯郸056000;2.邯郸市中心医院 风湿免疫科)

微小RNA-155在系统性红斑狼疮外周血单个核细胞中的表达

李 莉1，李淑敏1，张志涛1，王卫远2

(1.邯郸市传染病医院 检验一科，河北 邯郸056000;2.邯郸市中心医院 风湿免疫科)

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)中miRNA-155的表达水平及其对SLE预后的意义。方法 收集我院2013年9月-2016年3月确诊并治疗的SLE患者61例，根据SLE疾病活动指数分为轻度组26例，中重度组35例，同期选择30例健康体检者作为对照组。应用实时荧光定量PCR技术对入选者PBMC中miRNA-155的表达水平进行检测，对比分析各组表达情况。结果 与对照组相比，轻度活动组的miRNA-155表达水平无统计学差异(P>0.05)；中重度活动组miRNA-155水平明显高于对照组(P<0.05)。抗dsDNA抗体、24 h尿蛋白与SLE患者miRNA-155表达水平显著相关(P<0.05)；与无狼疮肾组相比，狼疮肾阳性组SLE患者miRNA-155水平显著升高(P<0.05)；与血液系统正常组SLE患者相比，异常组miRNA-155水平显著升高(P<0.05)。结论 中重度活动SLE患者PBMC中miRNA-155表达升高；miRNA-155表达与抗dsDNA抗体及24 h蛋白尿相关；miRNA-155在狼疮肾、血液系统异常中呈高表达。

系统性红斑狼疮；外周血单个核细胞；miRNA-155

(ChinJLabDiagn,2017,21:0833)

近年来，越来越多的研究表明系统性红斑狼疮(SLE)患者普遍存在miRNA异常，miRNA可能通过调节免疫细胞信号转异、免疫细胞分化等精细微调影响机体免疫功能[1]。经mircroRNA芯片技术发现miRNA-155在SLE患者外周血中显著高于健康个体，但对SLE活动度的评估尚不明确[2]。本次研究拟对miRNA-155在外周血单个核细胞(PBMC)相对表达量与患者临床特征关系进行观察，为评估SLE病情、预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择我院风湿免疫科2013年9月-2016年3月收治的SLE患者61例，根据SLE疾病轻重度分为两组：轻度组、中重度组。轻度组26例：男8例，女18例；年龄19-46岁，平均32.16±11.06岁；病程2-48个月，平均23.16±6.13个月；口腔溃疡9例，皮疹24例，头痛10例。中重度组35例：男12例，女23例；年龄18-48岁，平均32.98±12.06岁；病程3-47个月，平均24.02±7.18个月；口腔溃疡16例，皮疹32例，头痛12例，肾损伤(出现有白细胞尿、蛋白尿、血尿、肾功能异常)35例。同时选择在我院进行体检的健康人群30例作为对照组。各组年龄、性别无显著统计学差异(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，入选者或家属知情同意，符合医学伦理学标准。

1.2 纳入与排除标准

诊断标准：符合1997年美国风湿病学会推荐的SLE分类标准中的4项或4项以上者，特别是免疫学异常、高滴度抗核抗体异常者即可诊断。病情轻重度的评估：①轻型：高度怀疑或诊断明确的SLE患者，临床无明显内脏损害，SLE疾病活动指数(SLEDAI)<10分；②中重型：具有明显重要脏器累及且需要治疗者，SLEDAI≥10分[3]。排除感染、心脏病、高血压、糖尿病、肿瘤、其他结缔组织病；妊娠期、哺乳期妇女；凝血功能异常者。

1.3 检测方法

1.3.1 主要试剂 人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)、miRNA提取试剂盒(miRNAVanna PARIS Kit，Ambion)、TaqMan miRNA反转录试剂盒(美国应用生物系统公司)、miRNA检测试剂盒(TaqMan microRNA Assay Kit，美国应用生物系统公司)、Taqman通用PCR混合物(美国应用生物系统公司)。

1.3.2 PBMC分离 采集入选者肘部外周静脉血2 ml，应用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-k2)抗凝，置于-80℃保存，将4 ml淋巴细胞分离液先注入灭菌的15 ml离心管内，取2 ml EDTA-k2抗凝血缓慢加入淋巴细胞分离液液面上(尽量不掺入到淋巴细胞分离液层中)，进行离心(室温，2 000 r/min)20 min，取1 ml白细胞层与1 ml生理盐水混匀，再加入2 ml淋巴细胞分离液面，再次离心(室温，2 000 r/min)25 min，吸取云雾层，加入eppendorf管(1. 5 ml)中，之后离心(室温，7 000 r/min)10 min，丢弃上清。

1.3.3 mRNA反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA) 应用miRNA反转录试剂盒的操作说明对总RNA的miRNA反转录成cDNA。miRNA-155逆转录反应条件：16℃、42℃分别为30 min，85℃5 min；小分子RNA U6逆转录反应条件：37℃30 min、85℃5 min。将逆转录产物置于-20℃环境中备用。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应(PCR) 应用美国应用生物系统公司定量PCR仪(7300型)，以小分子RNA U6为内参，取20 μl反应体系进行PCR测定，每个标本做3个复孔，取miRNA-155的各标本平均循环阈值(cycle threshold,Ct)后减去U6 Ct值作为测评值(△CT)，该值越高则表达水平越低，该值越低则表达水平越高。由于样本间存在一定的不一致因素，因此需要对PCR结果进行分析，计算标准化后的2-△CT作为miRNA的相对表达量。

MiRNA-155正向引物序列(5’-3’)为CGTrAATGCTAATCGTGATAG，大小为21 bp；U6正向引物序列(5’-3’)CTcGCTTcGGcAGcACA，大小为17 bp；miRNA通用反向引物序列(5’-3’)物GCAGGGTCCGAGGT，大小为14 bp。

1.3.5 其他检测 按照院内常规方法测定血常规、尿24 h蛋白定量、尿常规、血清补体、自身抗体等。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 健康对照组与SLE患者PBMC中miRNA-155表达水平

标准化后的miRNA-155相对量：健康组为130.87±67.16，轻型组为141.26±63.17，中重度组为181.16±72.33。轻型组略高于健康组(t=0.59，P=0.56)；中重度显著高于健康组(t=2.89，P=0.01)；中重度组显著高于轻度组(t=2.25，P=0.03)。

2.2SLE患者miRNA-155表达水平与临床表现的关系

对入选的61例SLE患者实验室检查项目与标准化miRNA-155水平进行相关性分析，结果显示:抗dsDNA抗体、24h蛋白尿与miRNA-155呈正相关，且关系紧密(P<0.05)，详见表1。以SLE疾病活动评分>7分、白细胞或血小板降低，采血前24h糖皮质激素用量≥1mg·kg-1·d-1这三项作为划分依据，满足上述三项者为SLE阳性组，不满足者为阴性组；；以补体C3<0.8g/L、C4<0.2g/L来划分是否为低补体血症；以是否具有狼疮肾划分；以是否具有白细胞、血小板降低定义血液系统异常与否；分别比较阴性组、阳性组的miRNA-155水平，结果见表2。

表1 SLE临床特征与miRNA-155相关性

表2 SLE临床表现与miRNA-155水平关系

3 讨论

在我国的一份大样本一次性调查中显示，SLE患病率为70/10万人，其中女性患病率较高，为113/10万[4]。从本次观察的61例SLE患者的性别比例来看，女性占67.21%，符合本病的发病人群特点。有学者认为雌激素具有促进体液免疫反应的作用，因此SLE的女性发病率较男性高[5]。

miRNA是一类非编码RNA，具有高度保守性，通过与靶基因mRNA互补配对来降解mRNA或抑制翻译，进而负性调节转录后基因的表达。miRNA-155是位于人类21号染色体上的B细胞整合簇(B-cell integration cluster，bic)基因的第三外显子内，是典型的多功能基因，可以活化T细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫相关细胞，其表达水平受bic基因的转录水平、其他miRNA加工调控[6]。miRNA-155存在于多种人类恶性肿瘤中， miRNA-155失调控也与SLE、类风湿性关节炎、多发性硬化症等自身免疫性疾病相关[7]。

从本次研究的结果来看，miRNA-155在健康人与轻度SLE患者的表达水平不存在显著差异，说明miRNA-155对SLE诊断敏感性较弱，但是中重度组的miRNA与对照组、轻度组的显著性差异，提示miRNA-155对于靶器官损害与否的敏感性较好，推测miRNA-155在SLE靶器官损害中或发挥着一定作用。miRNA-155是BIC基因的表达产物，与B细胞的分化、增殖关系密切，同时也可活化T细胞分泌的细胞因子，能够抑制BMP信号及BMP介导的EBV重新激活，而这些导致的T、B细胞失调控则会促进自身抗体的产生[8]。在本次研究中，抗dsDNA抗体与miRNA-155表现出了显著的相关性，进一步证实了miRNA-155在SLE自身抗体产生中的作用。陈京京等对比了59例SLE患者、25例健康人的PBMC的miRNA-155、21的表达水平，结果显示与无狼疮肾炎组相比，狼疮肾炎组SLE患者miRNA-155、21表达水平明显升高(P<0.05)[9]。这与本次观察的结果一致，说明miRNA-155对SLE肾脏损害较为敏感，根据陈京京的研究结果推测miRNA-155可能参与了BMP通路，进而在狼疮肾的发生发展中发挥着作用。尹志华等对20例SLE患者和15例健康者的外周血分离PBMC、血浆中miRNA-155分别进行对比时显示，SLE患者PBMC中miRNA-155的表达水平是健康者的3.07倍，差异显著(P<0.05)，抗dsDNA抗体、C3下降、尿蛋白阴性组、阳性组间PBMC中未表现出miRNA-155水平差异(均P>0.05)[10]。尹氏研究结果表明PBMC中miRNA-155对SLE诊断的敏感性较好，这与本次研究结果基本一致，SLE临床指标上的差异或许是由于入选SLE患者活动程度不同、入选者数量较少等因素造成。

miRNA-155几乎参与了B细胞成熟的每个过程，因此在弥漫大B细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等中均有表达上调的表现[11]。薛华等研究认为，miRNA-155是一种表达在造血细胞的miRNA，通过影响细胞分化、增殖、凋亡的细胞信号转导途径来影响血液系统[12]。本次观察结果中miRNA-155水平在血液系统异常阳性组呈显著高表达，提示miRNA-155对血循环的影响明确，或可作为SLE是否累及血系统的观测指标。

有研究显示，SLE治疗过程中肾功能异常、心血管疾病、恶性肿瘤、骨质疏松等发生率不断增加，这些均可导致患者生活质量明显下降甚至死亡。国内的一项SLE5年期生存率及预后因素分析指出，肾功能衰竭、感染是最常见死因[13]；SLE患者亚临床和临床心血管疾病风险显著增加[14]；而SLE本身具有促进肺癌、淋巴瘤、肝胆管癌等恶性肿瘤发生的作用[15]。有学者认为SLE的早期治疗应以诱导疾病缓解为目的，而远期治疗则应注重减少器官损伤，从而提高患者生活质量[16]。可见，监测SLE发生发展情况，对改善患者预后生活质量具有重要意义，从本次观察的结果来看，miRNA-155在SLE侵犯肾、循环系统具有较好的敏感度，为早期诊断、治疗提供了一定参考，为及时采取治疗措施提供客观依据，这对改善SLE的预后情况具有积极意义。

综上所述，miRNA-155在PBMC中的表达水平对于SLE活动度的程度判断具有指导价值，高miRNA-155表达与狼疮肾、血系统异常、尿蛋白阳性的发生关系密切。本次研究SLE病例数较为有限，对SLE累及器官未做细致的分类miRNA-155水平的观察，这些均有待下一步研究探讨。

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Expression of minRNA-155 in peripheral blood mononuclear cells of systemic lupus erythematosus patients

LILi,LIShu-min,ZHANGZhi-tao,etal.

(HandanInfectiousDiseaseHospital,Handan056000,China)

Objective To investigate the Expression of minRNA-155 in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of systemic lupus erythematosus(SLE) patients and the the impact on prognosis.Methods 61 patients were selected from September 2013 to March 2016,who meet the diagnostic criteria of SLE from our hospital.According to SLE disease activity index 61 cases were divided into mild activity group 26 cases,moderate and severe activity group 35 cases.30 healthy persons were selected as control group.miRNA-155 expressions in PBMC was examined by real-time PCR.Results Compared with the control group,there was no significant difference in miRNA-155 expression of mild activity group(P>0.05).The levels of miRNA-155 in the moderate and severe activity group were significantly higher than those in the control group(P<0.05).The levels of dsDNA expression and 24h were significantly correlated with the levels of miRNA-155 expression in SLE patients(P<0.05).Patients with lupus nephritis had higher expression levels of miRNA-155 than thoses without(P<0.05).Patients with abnormal blood had higher expression levels of miRNA-155 than thoses without(P<0.05).Conclusion The moderate and severe activity SLE patients have higher expression of miRNA-155 in PBMC.The expression of miRNA-155 was associated with the urine of anti dsDNA and 24h proteins.MiRNA-155 was highly expressed in the abnormal renal and hematological abnormalities of lupus.

systemic lupus erythematosus；peripheral blood mononuclear cells；miRNA-155

1007-4287(2017)05-0833-04

R593.24

A

2016-08-13)