促肝细胞生长素对百草枯中毒引起大鼠急性肺损伤的影响

颜丽萍++凌顺++李弘++喻晓东++苏林++石晓萍++陈依鸽++闫玉栋

[摘要] 目的 研究促肝細胞生长素（pHGF）对急性百草枯中毒大鼠肺组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达及血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平的影响。 方法 将90只SD大鼠按照随机数字表法随机分为三组：非药物处理组，毒素处理组，治疗组，各组30只。毒素处理组、治疗组均以PQ（25 mg/kg）一次性腹腔注射染毒，治疗组予每天1次pHGF（50 μg/kg）腹腔注射，持续至第7天。各组于注射后第1、3、7天时间点处死相同数目大鼠，观察各组病理学变化，并收集血清及肺组织用于相关指标的检测分析。 结果 与非药物处理组比较，毒素处理组各时间点动脉氧分压（PaO2）均有不同程度下降，治疗组第1、3天相比毒素处理组PaO2有所改善（P < 0.05），第7天与毒素处理组比较，PaO2改善不明显（P > 0.05）；毒素处理组较非药物处理组肺组织Bax、Bcl-2蛋白表达及血清TNF-α水平明显增高（P < 0.01），而血清超氧化物歧化酶（SOD）活力明显降低（P < 0.01）；各时间点治疗组较毒素处理组肺组织中Bax蛋白表达及血清TNF-α水平降低（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达水平及血清SOD活力升高（P < 0.05）。 结论 pHGF对百草枯中毒大鼠急性肺损伤具有保护作用，其机制可能通过降低炎性反应、减少氧化损伤、抑制细胞凋亡来减轻肺损伤程度。

[关键词] 促肝细胞生长素；百草枯中毒；肺；细胞凋亡；凋亡相关蛋白

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（c）-0029-04

[Abstract] Objective To observe the effect of hepatocyte growth-promoting factor （pHGF） on the protein expression of Bcl-2 and Bax in lung tissue and serum tumor necrosis factor α （TNF-α） level in acute paraquat poisoning rats. Methods According to random number table， 90 SD rats were randomly divided into three groups： non drug treated group， venoms group， treatment group， with 30 rats in each group. The venoms groups and treatment group were treated with PQ （25 mg/kg） by a single intraperitoneal injection， treatment group was given pHGF （50 μg/kg） by intraperitoneal injection， once a day， for seventh days. A same number of the rats were sacrificed at the 1st day， 3rd day and 7th day， and the pathology change and the related indexes of each group in serum and lung tissue were observed. Results Compared with non drug treated group， PaO2 of the venoms group was decreased inordinately at each time point. Compared to poisoning group， the PaO2 of treatment group was improved at the 1st and 3rd day （P < 0.05）， the seventh day had no obvious change （P > 0. 05）. Compared with non drug treated group， the protein expression of Bcl-2 and Bax in lung tissue and serum TNF-α level in venoms group were significantly increased （P < 0.01）， whereas，the serum SOD activity was decreased obviously （P < 0.01）. Compared with poisoning group， Bax protein expression in lung tissue and serum TNF-α level were decreased （P < 0.05） and Bcl-2 protein expression and serum SOD activity were increased （P < 0.05） in treatment group at each time point. Conclusion pHGF can reduce the damage degree of lung tissue by reducing inflammation， reducing oxidative damage and inhibiting apoptosis.

[Key words] Hepatocyte growth-promoting； Paraquat poisoning； Lung； Cell apoptosis； Apoptosis-related protein

百草枯（PQ）是一种常见的剧毒性触杀型除草剂，在体内可以导致多个器官的损伤。肺是PQ中毒的主要靶器官[1]，常表现为早期的急性肺损伤及后期的肺纤维化[2]。PQ中毒机制复杂，细胞氧化损伤、炎症/细胞因子失调及细胞凋亡均证明参与了PQ中毒过程[3-4]。促肝细胞生长素（pHGF）是一种多功能细胞因子，在细胞增殖、血管生成及抗细胞调亡、修复损伤组织等方面发挥着重要的生物学功能[5]。研究证明，pHGF通过阻止肺泡细胞的调亡、促进肺泡细胞的再生及肺血管的生成提高大鼠的运动耐量、气体交换[6]。本研究通过PQ染毒大鼠建立肺损伤模型，探讨pHGF对PQ中毒大鼠急性肺损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与药物

20%PQ水溶液，由先正达南通作物保护公司提供；pHGF注射液（规格：2 mL∶30 μg，批号：1505029），购自威海赛洛金药业有限公司；Bax免疫组化试剂盒（批号：160708254ZC2）、Bcl-2免疫组化试剂盒（批号：160509660A）、免疫组化抗体稀释液（批号：160615452f）、二抗试剂（批号：2017049）及DAB显色剂试剂盒（批号：160509660A），购自上海迈新生物技术有限公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（批号：8260243）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20160602），购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物

90只SPF级健康成年SD大鼠，雌雄各半，日龄50～60 d，体重（200±20）g，购于桂林医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK桂2013-0001，批号：45000800000021，饲养条件：昼夜规律，温度18～25℃，相对湿度50%～70%。

1.3 动物模型的建立及分组

将90只SD大鼠按照随机数字表法分为三組：非药物处理组，毒素处理组，治疗组，各组30只。各组以第1、3、7天为观察点。毒素处理组、治疗组均以PQ（25 mg/kg）一次性腹腔注射染毒后，予治疗组每天1次pHGF（50 μg/kg）腹腔注射，持续至第7天，非药物处理组、毒素处理组注射等量生理盐水作为对照。

1.4 取材及样品制备

各组于第1、3、7天时间点取相同数目大鼠，以3 mL/kg的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，以胸腹正中线为切口，暴露心脏于心尖搏动处进针采血，并分离肺脏取肺组织固定于10%中性福尔马林溶液48 h后，常规石蜡包埋，备于HE染色及免疫组化检测。

1.5 动脉血氧分压（PaO2）检测及方法

采取0.3 mL动脉血置于抗凝管内，半小时内送往桂林市第二人民医院检验科，血气分析仪检测PaO2。

1.6 SOD、TNF-α测定及方法

将血浆于低温下经离心半径10 cm、3000 r/min离心20 min后，取上层清液血清，按照SOD、TNF-α试剂盒的步骤要求操作，分别应用水溶性四氮唑（WST-1）法、酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测SOD活力、TNF-α水平。

1.7 病理学检查及方法

常规脱水、石蜡包埋，制作切片，苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察各组大鼠肺组织病理组织学改变。

1.8 肺组织Bcl-2、Bax表达检测及方法

将肺组织切片按照说明书操作，应用免疫组织化学（二步法）检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果判断：细胞浆或细胞膜有棕黄色颗粒沉着为阳性表达，计分标准：每张切片随机选取5个高倍视野（10×40）观察下，根据染色细胞的阳性数目及染色程度对Bcl-2、Bax阳性表达进行半定量分析[7-8]：不着色者为0分，着色浅黄为1分，着色棕黄为2分，着色棕褐为3分；着色范围<5%计为0分，5%～<25%计为1分，25%～<50%计为2分，50%～ <75%计为3分，75%～100%计为4分；将每组各张切片的着色程度及着色范围分数相加为计为最后分数。

1.9 统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，利用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验，组间两两对比LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PaO2变化

与非药物处理组比较，毒素处理组各时间点PaO2值均显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；治疗组第1、3天PaO2值较毒素处理组增高，差异有统计学意义（P < 0.05），其中第3天差异有高度统计学意义（P < 0.01），第7天PaO2值与毒素处理组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 血清SOD活力改变

与非药物处理组比较，毒素处理组各时间点血清SOD水平均显著降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；治疗组与毒素处理组比较，各时间点血清SOD水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05），其中第3天差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.3 血清TNF-α水平变化

与非药物处理组比较，毒素处理组各时间点血清TNF-α水平均显著升高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；与毒素处理组比较，治疗组各时间点血清TNF-α水平均显著降低，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。见表1。

2.4 肺组织病理形态学改变

非药物处理组肺泡结构清晰，壁清晰完整，肺泡腔内未见渗出，肺间质正常，未见炎症细胞浸润。毒素处理组肺泡结构破坏，部分肺泡腔内可见渗出，肺间质水肿，肺间隔显著增宽，局部可见炎症细胞浸润，以第3天改变最明显，第3天后，上述改变减轻。治疗组表现为不同程度的肺泡炎改变，但肺泡结构破坏、肺间隔增宽及炎性细胞浸润程度均较毒素处理组改善。见图1。2.5 各组肺组织Bcl-2、Bax蛋白表达情况

非药物处理组可见少量Bcl-2和Bax蛋白表达，主要分布在肺支气管、肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的胞浆内。与非药物处理组比较，毒素处理组Bcl-2、Bax蛋白表达均明显增强，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与毒素处理组比较，治疗组Bcl-2蛋白在肺组织内表达明显增强，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05），Bax蛋白表达减少，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表2及图2～3（封三）。

3 讨论

pHGF是一种肝源性的生物活性小分子物质，主要应用于肝功能损害的辅助治疗[9]。pHGF可以促进HGF的表达，HGF是一种肺营养因子，具有促进肺血管内皮细胞分裂，诱导肺血管生成、肺泡上皮细胞生长，改善肺部炎症及调节上皮细胞凋亡的作用[10-12]。

低氧血症是衡量急性肺损伤程度及PQ中毒患者预后的重要因素[13]。本研究结果显示，毒素处理组大鼠各时间点PaO2出现不同程度下降，其机制可能与PQ中毒后大鼠肺泡细胞功能降低，肺组织充血水肿，肺泡间隔增宽及部分肺泡壁塌陷导致通气血流比失调有关；治疗组较毒素处理组，大鼠PaO2在第1、3天有一定程度的改善，提示pHGF对早期PQ中毒大鼠的低氧血症具有一定的改善功能，第7天PaO2改善不明显（P > 0.05），可能与大鼠肺内炎性渗出液吸收、减少，肺纤维化启动，肺功能暂时改善相关。

SOD是体内清除氧自由基（ROS）的重要酶之一，将ROS转化为H2O2、O2，当PQ诱发肺组织细胞产生大量的ROS超出SOD清除能力，机体的氧化-抗氧化体系失衡，检测SOD活性反映了机体清除ROS的能力，可作为PQ中毒患者的预测因子[14-15]。TNF-α是炎性反应的始动因子，可以增加炎症细胞浸润，分化并促进其他细胞因子、炎症递质的表达及分泌，形成錯综复杂的细胞因子网络，改变宿主的免疫应答能力[16]。研究证明，TNF-α与PQ中毒患者的预后存在相关性，对判断患者病情严重程度及转归具有预测作用[17]。本研究结果显示，毒素处理组SOD水平明显降低，TNF-α水平明显增高，提示细胞的氧化损伤、炎性反应参与了PQ中毒引起肺损伤过程。治疗组各时间点SOD出现升高，TNF-α水平降低，提示pHGF能通过清除ROS发挥抗氧化作用，并对机体的炎性反应具有抑制作用。

细胞凋亡是PQ中毒所致急性肺损伤的一个非常重要的过程，PQ可以激活Bcl-2家族不同成员触发细胞内细胞色素C释放发生细胞凋亡，Bcl-2为抗凋亡调节蛋白，Bax为促凋亡蛋白，两者形成一个凋亡调控系统[18-20]。本研究应用免疫组织化学技术检测Bcl-2、Bax蛋白在肺组织中的表达，采用Remmele等[21]提出的兼顾阳性细胞百分比和染色强度的四级分级法进行半定量分析，结果显示毒素处理组较非药物处理组肺组织Bcl-2、Bax蛋白表达明显增强，证明Bcl-2、Bax介导的细胞凋亡参与PQ中毒引起的肺损伤过程。予pHGF干预后，治疗组肺组织Bcl-2蛋白表达增强，Bax蛋白表达减弱，提示pHGF抑制了肺组织内细胞的凋亡，主要通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达及减少促凋亡Bax蛋白表达发挥保护作用。

综上所述，pHGF对PQ中毒大鼠急性肺损伤具有一定的保护作用，其机制可能与减轻细胞氧化损伤、抑制机体炎性反应及调节细胞凋亡相关。

[参考文献]

[1] Yang H，Wen Y，Bin J，et al. Protection of bone marrow mesenchymal stem cells from acute lung injury induced by paraquat poisoning [J]. Clin Toxicol，2011，49（4）：298-302.

[2] 舒维，陈文龙，谢姝，等.硫化氢对百草枯中毒大鼠急性肺损伤及炎症介质的影响[J].江西医药，2016，51（11）：1162-1164.

[3] Wang X，Luo F，Zhao H. Paraquat-induced reactive oxygen species inhibit neutrophil apoptosis via a p38 MAPK/NF-κB-IL-6/TNF-α positive-feedback circuit [J]. PLoS One，2014，9（4）：e93837.

[4] Dusinská M，Kovaciková Z，Vallová B，et al. Responses of alveolar macrophages and epithelial type Ⅱ cells to oxidative DNA damage caused by paraquat [J]. Carcinogenesis，1998，19（5）：809-812.

[5] 丁文捷，孙书珍.肝细胞生长因子及其受体与肾脏疾病[J].中国实用儿科杂志，2009，24（2）：145-147.

[6] Shigemura N，Sawa Y，Mizuno S，et al. Amelioration of pulmonary emphysema by in vivo gene transfection with hepatocyte growth factor in rats [J]. Circulation，2005，111（11）：1407-1414.

[7] 孟爱红，陈芝芸，严茂祥.银杏叶提取物对肝纤维化大鼠肝细胞凋亡的影响[J].中华中医药学刊，2009，27（10）：2095-2097.

[8] 肖欣.VEGF与MMP-9在口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌中的表达及意义[D].吉林：吉林大学，2016.

[9] 王乾兰.我国促肝细胞生长因子的研究和应用[J].中国生物工程杂志，2005，25（S1）：7-11.

[10] 周丹，吕福祯，陈英准.促肝细胞生长素对肺纤维化大鼠的干预作用及其途径[J].中国临床康复，2006，10（37）：74-77.

[11] Narasaraju T，Yang E，Samy RP，et al. Combination Therapy with Hepatocyte Growth Factor and Oseltamivir Confers Enhanced Protection Against Influenza Viral Pneumonia [J]. Curr Mol Med，2014，14（5）：690-702.

[12] 毕宁康，岳屹囡.促肝细胞生长素对肾缺血-再灌注大鼠肺损伤的影响[J].济宁医学院学报，2007，30（3）：185-188.

[13] Huang C，Zhang X. Prognostic significance of arterial blood gas analysis in the early evaluation of paraquat poisoning patients [J]. Clin Toxicol，2011，49（8）：734-738.

[14] 赵扬，谢继，杨志洲，等.血清髓过氧化物酶、丙二醛和超氧化物歧化酶水平对百草枯中毒患者的预后价值研究[J].临床急诊杂志，2016，17（1）：22-25.

[15] 朱宏飞，冯丹，姚尚龙，等.大潮气量机械通气对大鼠肺组织急性炎症、氧化应激及细胞凋亡的影响[J].华中科技大学学报：医学版，2010，39（1）：59-63.

[16] 唐文姣.百草枯中毒患者血清细胞因子与抗氧化能力相关性分析[J].中国现代医生，2013，51（27）：25-26.

[17] 龚媛，张浩，李晓莉，等.急性百草枯中毒早期患者细胞因子与动脉血气分析[J].中国工业医学杂志，2014，27（4）：279-280.

[18] Cai Q，Lu Z，Hong G，et al. Recombinant adenovirus Ad-RUNrf2 reduces paraquat-induced A549 injury [J]. Hum Exp Toxicol，2012，31（11）：1102-1112.

[19] 高艳敏，赵雄，丁佳，等.百草枯中毒大鼠的肝损伤及抗氧化药物对其保护作用[J].肝脏，2009，14（3）：210-213.

[20] Kastelan M，Massari LP，Brajac I. The role of Bcl-2 family proteins in psoriasis [J]. Lijecnicki Vjesnik，2010， 132（1/2）：31-33.

[21] Remmele W，Stegner HE. Recommendation for uniform definition of an immunoreactive score（IRS）for immuno？鄄histochemical estrogen receptor detection（ER-ICA）in breast cancer tissue [J]. Der Pathologe，1987，8（3）：138-140.

（收稿日期：2017-01-06 本文編辑：张瑜杰）