鱿鱼肌肉蛋白肽的制备工艺优化及其抗氧化活性

2017-06-01 12:21胡小军莫秋远王标诗苗碗根
食品工业科技 2017年5期
关键词:蛋白酶解鱿鱼清除率

胡小军,江 敏,莫秋远,王标诗,苗碗根

(岭南师范学院化学化工学院 广东高校新材料工程技术开发中心,广东湛江 524048)

鱿鱼肌肉蛋白肽的制备工艺优化及其抗氧化活性

胡小军,江 敏*,莫秋远,王标诗,苗碗根

(岭南师范学院化学化工学院 广东高校新材料工程技术开发中心,广东湛江 524048)

鱿鱼,抗氧化肽,抗氧化活性,响应面分析

自由基具有强氧化性,可损害机体的组织和细胞[1-2],引起衰老和慢性疾病[3],如心血管疾病、癌症、糖尿病及其它各种相关疾病[4]。在这种情况下,就需要及时补充抗氧化剂来清除过量的自由基,缓解自由基对机体造成的损伤。机体从体外获得的抗氧化剂按其来源可分为化学合成抗氧化剂和天然抗氧化剂大两类。合成抗氧化剂具有较强抗氧化能力,但是对人体有多种潜在的危害,所以开发天然抗氧化剂成为营养学研究的热点。抗氧化肽是天然抗氧化剂的一种,由于其安全、功能及易吸收,成为目前天然抗氧化剂开发的热点。制备抗氧化肽的方法常用酶解法,与化学法相比具有反应条件温和,不产生有毒副产物、无氨基酸破坏以及高效、易控等优点被广泛应用[5]。水产资源富含蛋白质,是开发抗氧化肽非常好的原料[6],如利用扇贝和鲶鱼开发抗氧化肽[7-8]。鱿鱼,其学名为中国枪乌贼,含有丰富的氨基酸,且人体必需氨基酸比重很大,是一种营养保健型渔业资源,极具营养价值。目前,国内鱿鱼深加工方法不多,且产品附加值较低[9]。有文献报道采用还原力为指标,正交旋转组合优化中性蛋白酶酶解鱿鱼制备抗氧化肽,但是未对抗氧化肽进行抗氧化活性研究[10]。本文以鱿鱼为材料,以清除羟自由基为指标,采用响应面法优化鱿鱼蛋白质酶解制备抗氧化肽工艺,同时对所得抗氧化肽进行抗氧化活性的研究,以期为鱿鱼深加工开发抗氧化肽以及抗氧化肽清除自由基预防氧化衰老提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱿鱼 湛江南华市场,洗净后绞成肉糜,置于-18 ℃冰箱中冷冻,备用。

超氧化物歧化酶试剂盒和谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒 南京建成生物工程研究所;蛋白酶:木瓜蛋白酶(6000 U/mg) 北京索莱宝科技有限公司;胰蛋白酶(1500 U/mg)、复合蛋白酶(2500 U/mg) 上海一基实业有限公司;DPPH Sigma公司;其他试剂均为分析纯。

Cintra10紫外可见分光光度计 澳大利亚GBC公司;centrifuge5810R 冷冻离心机 德国Eppendorf(艾本德)公司;MP1100B电子天平 上海济成分析仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱿鱼抗氧化肽制备工艺流程 鱿鱼肉→绞成肉糜→冷冻备用→解冻→加入适量蛋白酶→在蛋白酶的最适条件下进行酶解(见表1)→将酶解液在沸水浴中灭酶15 min→冷却→离心(4800 r/min,20 min)→上清液→滤膜过滤(0.45 μm)→透析处理(3500 u)→透过液→浓缩→冷冻干燥→鱿鱼抗氧化肽。

表1 不同酶水解鱿鱼蛋白的工艺条件(相同酶活力条件)

1.2.2 鱿鱼酶解最佳酶的筛选及单因素实验 精确称取3份10 g鱿鱼肉糜,加入100 mL pH8.0、5.8、6.8缓冲液,再分别加入表1三种酶,分别在45、55和50 ℃下,酶解3 h,酶解结束,将酶解液置于沸水浴中灭酶15 min,然后用自来水冷却到室温,再在4800 r/min条件下,低温离心20 min得上清液,经过滤、透析以及浓缩干燥得到鱿鱼多肽,测定清除羟自由基,筛选得到酶解最佳用酶。采用最佳酶,进行单因素实验,分别考察酶解时间、加酶量以及酶解温度对羟自由基清除率的影响。

1.2.3 响应面法优化鱿鱼蛋白酶解工艺条件 根据的Box-Behnken 实验设计原理,精确称取10 g鱿鱼肉糜,以羟自由基清除率为指标(Y),综合单因素实验结果,选取酶解时间、加酶量、酶解温度三个对抗氧化肽抗氧化活性影响最大的因素,对鱿鱼蛋白酶解工艺条件进行响应面分析,因素水平表见表2。

表2 响应面法优化酶解工艺各因素和水平设计

1.2.4 鱿鱼抗氧化肽抗氧化活性实验 清除DPPH·活性,采用Zhu等报道的方法[11],分别取2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液置于6支试管中,分别加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL抗氧化肽溶液,使浓度分别达到5、10、15、20、25、30 mg/mL,同时补充蒸馏水至4 mL,室温放置30 min后,在517 nm处测定其吸光度值(Ai),以2 mL 95%乙醇加入2 mL蒸馏水调零,对照为2 mL DPPH·溶液加上2 mL 95%乙醇在517 nm测定吸光度值(Ac),不同浓度的抗氧化肽溶液和2 mL 95%乙醇混合后在517 nm测定吸光度值(Aj)。抗氧化肽对DPPH·的清除率用抑制率表示为:

R(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

清除·OH活性,采用邻二氮菲法测定抗氧化肽清除羟自由基活性[12]。测定方法如下:

取6支试管,分别加入0.6 mL邻二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L,pH7.4)混匀后,分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL抗氧化肽溶液(浓度达到5、10、15、20、25、30 mg/mL)及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混匀后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),以去离子水补至体积2.8 mL,充分混匀后加入0.8 mL H2O2(0.1%),摇匀后于37 ℃保温1 h,在536 nm处测吸光度值A样品。以去离子水代替样品,其余步骤同样品管,测得吸光度值为A损伤。以去离子水代替H2O2,其余步骤同损伤管,所测得吸光度值为A未损伤。按照下式计算OH·清除率:

清除率(%)=(A样品-A损伤)/(A未损伤-A损伤)×100

式(2)

清除率(%)=(A0-A1)/A0×100

式(3)

其中:A0-邻苯三酚自氧化速率;A1-抗氧化肽抑制邻苯三酚自氧化速率。

小鼠体内抗氧化活性实验,参考王硕等的方法[14],略加修改。将60只实验小鼠随机分成三组,分别是对照组(control)、鱿鱼抗氧化肽高剂量组(SAP-H)和低剂量组(SAP-L),每组20只。小鼠适应饲养一周后,制备衰老模型,三组每天注射D-半乳糖,注射剂量100 mg/g。SAP-H和SAP-L组每天灌胃鱿鱼抗氧化肽溶液,剂量分别为20 mg/g和5 mg/g,对照组每天灌胃等量盐水,连续给药48 d,期间小鼠自由摄食饮水,每天称量体重,根据体重调整灌胃剂量。末次给药后,禁食24 h,小鼠摘眼球取血,4 ℃冰箱静置12 h,3000 r/min 低温离心10 min,取上层血清,测定超氧化物歧化酶和谷胱甘肽酶活性。

1.3 数据统计分析

所有实验重复3次以上,采用Excel和SPSS19.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶酶解效果筛选及单因素实验

三种蛋白酶酶解鱿鱼蛋白结果见图1,在相同酶活和相同酶解时间条件下,木瓜蛋白酶所得抗氧化肽对羟自由基清除率最高,达到63.08%±0.63%,而另外两种蛋白酶清除率相对较低。所以选择木瓜蛋白酶作为酶解用酶。鱿鱼蛋白酶解单因素结果见图2、图3和图4,由图可知,不同鱿鱼蛋白酶解条件对羟自由基清除率影响都有先增后减小的趋势,同时说明鱿鱼蛋白酶解过程具有最佳的反应条件。从图2可以看出,随着酶解时间的延长,清除率呈现增大趋势,5.5 h后开始降低,所以5.5 h是最佳酶解时间。图3可以看出,加酶量0.06 g/10 g是影响清除率的变化点,所以加酶量为0.06 g/10 g为最佳用酶量。从图4看出,酶解温度在55 ℃,羟自由基的清除率达到最大值,所以选择55 ℃为最佳酶解温度。

图1 不同蛋白酶对羟自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of different protease against OH·

图2 不同酶解时间对羟自由基清除率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on scavenging rate of OH·

图3 不同加酶量对羟自由基清除率的影响Fig.3 Effect of amount of enzyme on scavenging rate of OH·

图4 不同温度对羟自由基清除率的影响Fig.4 Effect of temperature on scavenging rate of OH·

2.2 响应面优化鱿鱼蛋白酶解工艺

2.2.1 响应面实验结果 按照1.2.2和1.2.3方法进行响应面设计,具体实施方案和结果见表3。

表3 RSM优化鱿鱼蛋白酶解方案与实验结果

根据实验结果建立的数学模型为:(Y)=-9.37808+0.66028A+54.39442B+0.35765C-2.75844AB+8.98240×10-4AC+0.18288BC+0.044141×A2-348.56100B2-3.33348×10-3C2

2.2.2 模型方差分析 为了检验回归方程的有效性,对回归模型进行方差分析,结果见表4,从分析结果可以看出,模型p=0.001,回归模型极其显著;在三个因素当中,酶解时间、加酶量对羟自由基清除率影响最为显著(p<0.001);失拟项p=0.0568,不显著,同时回归模型的相关系数R2=0.9770,响应值的97.70%与所选变量有关系,说明模型拟合程度良好,能较准确地预测和分析实际情况。

2.2.3 最优条件及验证实验 根据所建立的数学模型进行参数最佳化分析,得酶解产物清除羟自由基活性最强所需的参数条件为:酶解时间为5.77 h,加酶量为0.07 g/10 g、酶解温度为54.77 ℃,清除率预测值为92.02%。将实验条件修正为:酶解时间6 h,加酶量为0.07 g/10 g,酶解温度为55 ℃,进行验证实验得羟自由基清除率为90.31%±0.54%,该结果与预测值差值仅占预测值的1.86%。由此认为该二次模型合理,实验结果较为理想。

表4 响应面二次模型方差分析


注:p<0.05,差异显著;p<0.01,差异极显著。

2.3 抗氧化活性实验

2.3.1 清除DPPH·活性 鱿鱼抗氧化肽清除DPPH·结果见图5。由图5可知:鱿鱼抗氧化肽对DPPH·有明显的清除能力,且随浓度的增加清除效果增强,存在明显量效关系。当抗氧化肽浓度达到30 mg/mL,其对DPPH·清除率达到92.06%±0.87%。抗氧化肽浓度与DPPH·清除率拟合曲线为:y=2.109x+31.375,其相关系数为R2=0.9873。鱿鱼抗氧化肽清除DPPH·的EC50(半数清除率)值为8.8 mg/mL。

图5 抗氧化肽对DPPH·清除效果Fig.5 The scavenging effect of antioxidant peptide against DPPH

2.3.2 清除·OH活性 鱿鱼抗氧化肽清除·OH结果见图6。由图6可以看出:随着抗氧化肽浓度的增加,对·OH的清除率也呈现增加趋势;当抗氧化肽浓度为30 mg/mL时,对·OH的清除率为81.00%±0.73%。在实验范围内,浓度与自由基的清除率拟合的曲线为:y=2.8543x-3.0333,其相关系数R2=0.9914。鱿鱼抗氧化肽清除·OH的EC50值为16.5 mg/mL。

图6 抗氧化肽对·OH清除效果Fig.6 The scavenging effect of antioxidant peptide against ·OH

图7 抗氧化肽对·清除效果Fig.7 The scavenging effect of antioxidant peptide against ·

2.3.4 体内抗氧化活性 小鼠体内抗氧化活性结果见图8,鱿鱼抗氧化肽高低剂量组的小鼠体内SOD活性分别比空白组高19.2%和14.2%。而抗氧化肽高低剂量组小鼠体内的GSH比空白组提高了23.4%和14%。说明鱿鱼抗氧化肽能提高小鼠体内抗氧化酶的活力,促进衰老过程中产生的自由基的清除,具有较强的体内抗氧化活性。

图8 抗氧化肽对小鼠体内抗氧化酶活性的影响Fig.8 Effect of antioxidant peptide on the activities of enzymes

3 结论

采用酶解技术对鱿鱼蛋白进行酶解制备抗氧化肽,通过Box-Behnken 实验设计以及响应面分析对鱿鱼蛋白酶解工艺进行优化,得出最佳酶解工艺条件为酶解时间6 h,加酶量为0.07 g/10 g,酶解温度为55 ℃,在此条件下得到鱿鱼抗氧化肽的羟自由基清除率为90.31%±0.54%,同时得到清除率与酶解各因素变量的二次方程模型,该回归模型极显著,对于实验拟合较好。

通过体内体外抗氧化活性实验,得出鱿鱼抗氧化肽对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基有较强的清除作用,EC50值分别是8.8、16.5 mg/mL和10.3 mg/mL。通过小鼠体内抗氧化实验,和对照组相比,鱿鱼抗氧化肽能提高衰老小鼠的SOD酶和谷胱甘肽酶的活性,拮抗D-半乳糖导致衰老小鼠的氧化损伤,表明鱿鱼抗氧化肽具有很好的抗氧化活性。

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Optimization of preparation technology and antioxidant activity of squid protein peptides

HU Xiao-jun,JIANG Min*,MO Qiu-yuan,WANG Biao-shi,MIAO Wan-gen

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Lingnan Normal University,Development Center for New Materials Engineering & Technology in Universities of Guangdong,Zhanjiang 524048,China)

The effects of enzymatic hydrolysis time,temperature,and amount of enzyme on the removal of hydroxyl radical from squid muscle were investigated. The enzymatic technology of squid protein was optimized by Box-Behnken design and response surface methodology(RSM). In the meantime,the antioxidant activities of squid antioxidant peptides were studied by using free radical scavenging and antioxidant activity in mice. The results showed that the hydroxyl radical scavenging rate was significantly affected by time and amount of enzyme. The optimum conditions were enzymatic hydrolysis time 6 h,amount of enzyme 0.07 g/10 g,enzymolysis temperature 55 ℃,under which the hydroxyl radical scavenging rate was 90.31%±0.54%. The EC50of antioxidant peptide from squid against DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion radical were 8.8,16.5mg/mL and 10.3mg/mL,respectively. SOD activity of Squid antioxidant peptide in the high and low dose group mice was higher than the control group of 19.2% and 14.2%. GSH activity of Squid antioxidant peptide in the high and low dose group mice was higher than the control group of 23.4% and 14%. Squid antioxidant peptides had strong antioxidant activity through antioxidant experimentsinvitroandinvivo.

squid;antioxidant peptide;antioxidant activity;response surface analysis

2016-09-06

胡小军(1977-),男,硕士,讲师,研究方向:食品的深加工与功能成分制备,E-mail:yan2001j@126.com。

*通讯作者:江敏(1977-),女,硕士,实验师,研究方向:食品加工技术与产品开发,E-mail:jiangmin9715@163.com。

国家级星火计划项目(2013GA780083);湛江市财政资金科技专项项目(2013C01029);2013年地方高校国家级大学生创新创业训练项目(2010404139);岭南师范学院热带与南海资源协同创新中心项目(CIL1503);岭南师范学院自然科学研究项目(YL1404)。

TS254.1

B

1002-0306(2017)05-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.027

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