纸葡萄穗霉降解β-胡萝卜素的产香研究

段焰青，杜刚，党立志，曾熠程，李青青*

（1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650231；2.云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室，云南昆明650500；3.西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224）

纸葡萄穗霉降解β-胡萝卜素的产香研究

段焰青1，杜刚2，党立志1，曾熠程1，李青青3*

（1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650231；2.云南民族大学民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室，云南昆明650500；3.西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224）

从采自云南昆明的22份不同陈化时间的烟草样品中筛选到6株可降解β-胡萝卜素的真菌。菌株YNCA9037可降解β-胡萝卜素，获得具甜木香味的发酵产物，经菌落形态、显微形态及转录间隔区（ITS）序列分析进行菌株分类鉴定，菌株YNCA9037初步鉴定为纸葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素的产香条件进行初步研究，其较佳产香的条件为：pH 6.5，发酵温度28℃，发酵时间72 h，β-胡萝卜素添加量0.2%。菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素的发酵产物经气质联用（GC-MS）法分析，检测到致香物质β-环柠檬醛和β-紫罗兰酮。

纸葡萄穗霉；β-胡萝卜素；菌株鉴定；致香物质

DUAN Yanqing1,DU Gang2,DANG Lizhi1,ZENG Yicheng1,LI Qingqing3*
(1.Technology Center,China Tobacco Yunnan Industrial Co.,Ltd.,Kunming 650231,China;2.Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission&Ministry of Education,Kunming,650500,China;3.College of Life Science, Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

类胡萝卜素是一大类自然界广泛分布的四萜类化合物[1]，它作为生理抗氧化剂，具有抗肿瘤、抗衰老等功效，由于其无毒无害且着色能力良好，也作为食品着色剂使用[2-4]。类胡萝卜素降解可产生β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和β-大马酮等致香物质[5-6]，因这类致香物质具有较低的感官阈值，是许多香料的特征香味[7]，然而在天然材料中这类香味物质含量极低，且提取成本昂贵。近年来一些研究者尝试通过酶或微生物体系模拟类胡萝卜素的自然降解获得新型香料[8]。NINGRUM A等[9]从七叶兰叶片中得到的粗酶降解β-胡萝卜素，获得β-紫罗兰酮。杨雪鹏等[10]以霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）A20降解类胡萝卜素可产生香味物质。SÁNCHEZ-CONTRERAS A等[11]以地丝菌属菌株（Geotrichumsp.）和芽孢杆菌（Bacillussp.）两株菌混菌培养，降解叶黄素产生紫罗兰酮和紫罗兰醇等有烟草特征香味的物质。ZELENA L等[12]以来源于蒜头状小皮伞的过氧化物酶降解叶黄素得到3-羟基-β-紫罗兰酮和3-羟基-α-紫罗兰酮，降解β-胡萝卜素得到β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛和二氢猕猴桃内酯等致香物质。

葡萄穗霉属壳霉目、杯霉科真菌，是广泛存在于自然界的霉菌[13]，同时是很重要的植物病原菌[14]。目前，利用微生物降解类胡萝卜素产香尚未实现大规模应用，本实验从云南昆明的22份不同陈化时间的烟草样品中筛选到6株可降解β-胡萝卜素的真菌，并对其中可降解β-胡萝卜素菌株YNCA9037进行分子生物学鉴定，对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素的产香条件进行初步研究。通过本研究为微生物降解类胡萝卜素获取致香物质提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源

云南昆明陈化1～3年的烟叶22份：由红云红河集团提供。

1.1.2 培养基

内生真菌活化采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃灭菌25 min。

β-胡萝卜素降解筛选培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，β-胡萝卜素0.2%，琼脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃灭菌25 min。

液体发酵培养基：NaNO32 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41g，FeSO4·7H2O0.01g，KCl0.5g，β-胡萝卜素0.2%，琼脂20 g，定容至1 L，pH值6.8。121℃灭菌25 min。

1.1.3 化学试剂

β-胡萝卜素（纯度30%）：德国巴斯夫公司；琼脂粉：北京奥博星生物技术有限公司；二氯甲烷（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；其他试剂采购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Tanon 2500凝胶成像系统：上海天能科技有限公司；TGL-15B高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；5331型PCR仪：德国Eppendorf股份公司；Nikon ECLIPSE E200显微镜：北京冠普佳科技有限公司；ScoutⅡ电子天平：奥豪斯国际贸易上海有限公司；SW-CJ-ZFD无菌操作台：苏净集团安泰公司；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；ZHWY-2102恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；HP-900隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；ISQ气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 β-胡萝卜素储备液制备

将β-胡萝卜素（30%）5 g溶于10 mL二氯甲烷中，然后加入1 g Tween-80进行乳化。将二氯甲烷自然挥发，再加入100 mL无菌蒸馏水混合得乳浊液储备待用。

1.3.2 降解β-胡萝卜素目标菌株的平板筛选

以三点法对待筛选菌株进行纯化，纯化菌株接种于斜面，再接种于β-胡萝卜素降解筛选培养基上，能使培养基褪色的菌株为待选菌株。

1.3.3 降解β-胡萝卜素产香菌株的筛选

将待选菌株斜面接入发酵培养基中培养，置于恒温培养振荡器，180r/min、30℃条件下发酵5d，每株菌以相同的条件不添加底物发酵作空白对照。发酵液过滤后用二氯甲烷1∶1萃取为待检测样品。

1.3.4 菌株YNCA9037的形态鉴定

将菌株YNCA9037接种于平板培养基，28℃恒温条件下培养3 d，记录形态、干湿、颜色等菌落特征。

显微特征观察：插片法培养，把灭过菌的盖玻片45度角插入PDA平板中，将菌种接种于盖玻片的基部，使真菌菌丝迎着培养基表面附着于盖玻片上，28℃恒温条件下培养3～4 d后，用镊子轻轻取出盖玻片，置于载玻片上制成临时装片进行显微形态观察，记录其菌丝、孢子囊、孢子梗、分生孢子形态特征及与营养体之间的着生关系等。根据魏景超[15]《真菌鉴定手册》，将真菌分类至纲、目、科、属。1.3.5菌株YNCA9037的分子鉴定

菌株YNCA9037脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）提取：活化斜面菌种接种于100mLPDA液体培养基，28℃条件下培养4 d，取5 mL发酵液于12 000 r/min条件下离心10 min，收集菌丝体，以液氮冻融-十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取真菌DNA。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系（25 μL）：DNA Tax MIX，10 μL；引物ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，2 μL；引物ITS5 5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，2 μL；模板DNA，2μL；纯净水，9μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30 s；50℃退火30 s；72℃延伸1.5 min；72℃末端延伸10 min；循环30次；4℃保存。PCR产物电泳检测：取0.75 g琼脂糖于50 mL 0.5×四溴乙烷（tetrabromoethane，TBE）缓冲液中，加热煮沸2min，稍冷后加入1.5μLGoldView染色液，摇匀倒胶。将所得的PCR扩增产物和Marker分别取5 μL到琼脂糖凝胶上，在0.5×TBE缓冲液中电泳，电压80 V。电泳结束后凝胶成像仪系统记录。PCR扩增产物的纯化及序列测定经琼脂糖凝胶电泳检测后送昆明硕擎生物技术有限公司测序。

所测序列在GeneBank基因库中进行Blast比对，用MEGA7.0进行系统发育树的分析构建。

1.3.6 菌株YNCA9037产香发酵条件研究

培养基初始pH：将液体培养基的pH分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28℃、180r/min条件下振荡培养72h，考察培养基初始pH对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素产香的影响。

培养温度：将接种后的液体发酵培养基（pH 6.5）分别置于20℃、25℃、28℃、32℃、35℃、40℃条件下，180 r/min振荡培养72 h，考察培养温度对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素产香的影响。

培养时间：将接种好的液体培养基（pH 6.5）在28℃、180r/min条件下分别培养48h、72h、96h、120h、144h、168h、192 h，考察培养时间对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素产香的影响。

β-胡萝卜素的添加量：将接种好的液体培养基（pH 6.5），在28℃、180 r/min条件下振荡培养72 h，β-胡萝卜素添加量为0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、1.00%，考察β-胡萝卜素的添加量对菌株YNCA9037降解β-胡萝卜素产香的影响。

发酵产物由10名专业人士对产香质量进行评价，优选出较好的发酵方式。

1.3.7 菌株YNCA9037发酵样品香味成分的GC/MS分析

菌株YNCA9037发酵β-胡萝卜素的50 mL样品，先进行抽滤，再加入50 mL二氯甲烷萃取，进行气相色谱-质谱（GC-MS）联用分析检测。

气相色谱条件：TR-1MS色谱柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）；载气：氦气（He）（纯度99.999%）；升温程序：60℃保持1 min，以10℃/min的速度升至120℃，保持1 min，然后以2℃/min的速度升至140℃，保持1 min，再以5℃/min的速度升至200℃，保持1 min；柱流量：0.8 mL/min；进样量1 μL；进样口温度250 ℃；分流比30∶1，溶剂延迟3 min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电离电压70 eV；离子源温度260℃；扫描范围30～500 m/z。

定性方法：各香气组分质谱图经计算机美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库检索及相关资料的分析，对香气成分进行分析比对定性。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素降解菌株的筛选

从筛选平板上发现可产生明显透明圈的6株菌，分别为菌株YNCA9013、YNCA9022、YNCA9023、YNCA9031、YNCA9037和YNCA9043。将6株菌接种于含类胡萝卜素的液体培养基中，28℃发酵96 h后6株菌都可使液体培养基褪色。菌株YNCA9013、YNCA9022的发酵液有果香味，但味道较淡；菌株YNCA9037产生较浓的甜木香味；其余菌株发酵液没有香味，未接种菌株的对照样发酵前后没有味道变化。因此，对菌株YNCA9037进行分子生物学鉴定。

2.2 类胡萝卜素降解菌株的分类鉴定

菌株YNCA9037形态特征如图1所示。由图1可知，菌株YNCA9037菌落大，呈毛絮状，黑褐色，边缘白色，背面黑褐色；菌丝体不发达，菌丝光滑透明、有隔；孢子梗和孢子囊为黑色或褐色，分生孢子簇生于孢子梗顶端的瓶形小梗上，初步鉴定YNCA9037菌株为葡萄穗霉属（Stachybotrys）。

以菌株YNCA9037提取的DNA为模板，ITS进行PCR扩增如图2所示，表明扩增片段在500～750 bp。测序结果表明，菌株YNCA9037的ITS序列长566 bp。测序结果在GenBank中进行同源性比对，采用MEGA7.0软件，以领接法构建菌株YNCA9037的系统发育树，结果见图3。由图3可知，YNCA9037与Stachybotrys聚为一大簇，与纸葡萄穗霉菌株Stachybotrys chartarumstrain CBS 136172聚为一簇，同源性为99%，初步鉴定菌株YNCA9037为纸葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。

图1 菌株YNCA9037的菌落（a）及显微（b）形态Fig.1 Colony(a)and microscopic(b)morphology of strain YNCA9037

图2 菌株YNCA9307的ITS序列PCR扩增产物检测结果Fig.2 Detection results of ITS sequence PCR amplified products strain YNCA9307

图3 菌株YNCA9037基于ITS序列N-J法构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain YNCA9037 based on ITS sequence with N-J method

2.3 菌株YNCA9037产香发酵条件研究

培养基初始pH实验中pH 6.5发酵液香味最好，表明最适宜的初始pH为6.5；培养温度实验中28℃发酵液香味最好，温度过低香味较淡，温度高于32℃产生异味，表明最适宜的发酵温度为28℃；培养时间实验中72 h发酵液香味最好，超过72 h香味逐渐变淡，表明最适宜的发酵时间为72 h；β-胡萝卜素添加量＞0.1%时香味较淡，添加量为0.2%与0.4%的香味相当，β-胡萝卜素添加量超过0.6%时产生异味，表明最适宜的β-胡萝卜素添加量为0.2%。

2.4 菌株YNCA9037发酵样品香味成分的GC/MS分析

纸葡萄穗霉菌株YNCA9037发酵β-胡萝卜素产生甜木香味，对该样品进行GC-MS分析，结果见图4。由图4可知，发酵样品检测到保留时间9.86 min的峰为β-环柠檬醛，保留时间18.54 min的峰为β-紫罗兰酮。β-环柠檬醛和β-紫罗兰酮为β-胡萝卜素降解产物，β-环柠檬醛具有果香和花香香气，香气类似紫兰酮和鸢尾，并带有清凉和木香，稍有油腻的气息，β-紫罗兰酮香气较为柔，木香稍重，具有覆盆子的香味，稀释后有类似紫罗兰花的香味。但发酵产物含量较低，含有一定刺激性气味，还需进一步优化发酵条件。

图4 菌株YNCA9037发酵样品香气成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of aroma components in the fermentation samples of strain YNCA9037 analysis by GC-MS

3 结论

本实验从采自云南省昆明市的22份不同陈化程度的烟草样品筛选到6株可降解类胡萝卜素的真菌，经菌落及菌体的显微形态观察比对，初步鉴定为葡萄穗霉属菌株，结合ITS序列分析对菌株进行分类鉴定，初步鉴定菌株YNCA9037为纸葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）。对其降解β-胡萝卜素进行初步发酵条件研究，最适宜的初始pH为6.5，最适宜的发酵温度为28℃，最适宜的发酵时间为72 h，最适宜的β-胡萝卜素添加量为0.2%。纸葡萄穗霉菌株YNCA9037发酵样品经GC-MS分析，检测到β-环柠檬醛和β-紫罗兰酮等致香物质。ZORN H等[16]的研究中筛选出可降解类胡萝卜素的2株酵母和8株丝状真菌，β-胡萝卜素的降解产物中也发现β-紫罗兰酮和β-环柠檬醛等香味物质。本研究建立筛选降解β-胡萝卜素菌株的方法，初步研究了纸葡萄穗霉降解β-胡萝卜素的产香条件，为进行放大发酵和工业化生产新型香料提供了技术支持。

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TS201.3

0254-5071（2017）05-0105-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.022

2016-12-21

云南中烟工业有限责任公司项目（2015539200340277）；云南省科技厅项目（2015BA006）；云南省技术创新人才项目（2016HB009）；中国烟草总公司科技项目（110201402040）

段焰青（1974-），男，研究员，博士，研究方向为微生物香料。

*通讯作者：李青青（1976-），女，副教授，博士，研究方向为分子生物学。