酱油渣中色素及大豆异黄酮的提取研究

王帅，朱新贵，*，李学伟

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.李锦记（新会）食品有限公司，广东江门529156）

酱油渣中色素及大豆异黄酮的提取研究

王帅1，朱新贵1，2*，李学伟2

（1.华南农业大学食品学院，广东广州510642；2.李锦记（新会）食品有限公司，广东江门529156）

应用乙醇溶液和超声波辅助的提取方法，从大豆原粒酱油渣中提取酱油色素，并利用乙酸乙酯萃取回收乙醇提取液中的大豆异黄酮。结果表明，酱油渣中色素的最佳提取工艺为乙醇体积分数65%、料液比1∶1.75（g∶mL）、提取时间24 h、超声波时间35 min。在该条件下，酱油渣色素得率为1.8 g/100 g；高效液相色谱法分析，大豆异黄酮得率约为37 mg/100 g。光谱分析表明，酱油渣色素在紫外和红外区间均有非常强的吸收峰。色素稳定性分析表明，酱油渣色素容易被过氧化氢氧化，而亚硫酸钠对其有一定的增色作用；蔗糖、苯甲酸钠、山梨酸钾和光照对酱油渣色素的稳定性影响较小，偏酸性和80℃以上的高温环境对酱油渣色素具有降解作用。

酱油渣；提取；色素；大豆异黄酮

WANG Shuai1,ZHU Xingui1,2*,LI Xuewei2
(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China; 2.Lee Kum Kee(Xinhui)Food Co.,Ltd.,Jiangmen 529156,China)

酱油渣是酱油酿造结束后酱醪被压榨或抽取酱油后剩下的残渣，原料除了蛋白质和淀粉被大量利用外，其他成分的利用率较低。目前世界酱油年产量约800万t，其中中国大陆约500万t，且市场年增长率在10%以上[1-2]。据统计，我国每年用于酿造酱油所消耗的全大豆约为50万t左右，产生的黄豆酱油渣将近22万t。由于酱油渣的水分、盐分和氧化油脂含量高，一般生产厂家通常以低价售给养殖企业或农民作为饲料用于猪、家禽、鱼类的养殖，或被用作饲料添加物，甚至被丢弃处理，从而造成大量资源浪费，处理不当还会造成环境污染[3]。因此，大量的酱油渣已经成为酱油行业迫切需要解决的问题。

酱油渣中除含有蛋白、油脂和纤维素外，还含有色素、大豆异黄酮、皂苷、磷脂等具有生物活性的物质，可广泛地用于保健食品与医药行业。目前，在酱油渣综合利用方面，日本和韩国处于领先水平，其中针对酱油渣中色素与大豆异黄酮的研究已出现一些相关报道，但总体利用率不高，也没有形成产业化。酱油渣色素源自发酵酱油渣，自身具有一定的抗氧化作用，是一种非常具有开发潜力的天然黑色素，在食品、医药、保健等领域具有较好的开发应用前景[4-7]。大豆异黄酮是一种天然植物雌激素，具有多种生物学作用，除抗肿瘤作用外，还对衰老、心血管疾病、骨质疏松症及更年期综合症具有预防和治疗作用[8-12]。

本研究利用有机溶剂和超声波相结合的方法提取大豆原粒酱油渣中的色素，运用紫外和红外光谱分析酱油渣色素的光谱性质并对其分子中的结构进行推测；通过研究氧化剂、还原剂、防腐剂以及糖、光照、温度、pH等条件对酱油渣色素的影响，分析酱油渣色素的应用稳定性；利用乙酸乙酯萃取回收酱油渣乙醇提取液中的大豆异黄酮，并利用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定乙醇提取液中的大豆异黄酮含量。本研究以酱油渣的高值化利用为目的，为酱油渣中综合提取色素和大豆异黄酮提供工艺基础，对于促进酱油产业的健康发展、减少酱油渣对环境的污染、提高社会经济效益等都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆原粒酱油渣：以大豆为原料高盐稀态发酵满3个月，未经干燥（水分含量60%）和压榨等处理的原渣，李锦记（新会）食品有限公司提供；食用酒精：广东徐闻龙糖酒精有限公司；DA201-CⅡ型大孔树脂：江苏苏青水处理集团公司；大豆苷元（纯度＞98%）、染料木素（纯度＞98%）、黄豆黄素（纯度＞98%）标准品：美国Agilent科技有限公司；乙酸乙酯、乙酸、石油醚、过氧化氢、亚硫酸钠、蔗糖、苯甲酸钠、山梨酸钾、磷酸氢二钠、柠檬酸（均为分析纯）、甲醇（色谱纯）：广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪器RE 52-9：上海亚荣生化仪器厂；N4紫外可见分光光计：上海仪电科学仪器有限公司；ZK-82型电热真空干燥箱：上海市实验仪器总厂；KQ3200E型超声波器（40kHz，150W）：昆山市超声仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；SPH-2102CS型恒温培养振荡器：上海世平实验设备有限公司；FT/IR-400/600傅立叶变换红外光谱仪：JASCO日本分光公司；SPD-20A高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 酱油渣提取酱油色素工艺流程

取100.0 g酱油渣按照一定料液比加入体积分数75%乙醇溶液后，立即进行40 kHz超声波处理，然后常温下静置浸提一定时间（超声波时间包括在整个提取时间内）。乙醇提取液经蒸发浓缩至无醇味加入20 mL乙酸乙酯，分液漏斗中萃取分液。上层乙酸乙酯溶液经40℃真空浓缩干燥，得到淡黄色大豆异黄酮粗品；下层色素溶液参考韩成秀等[13]优化的DA201-CⅡ型大孔树脂最佳脱色工艺条件，按照每30 mL下层色素溶液加入10 g大孔树脂的比例，30℃恒温振荡器中200 r/min振荡吸附4 h。吸附后过80目筛，去离子水冲洗大孔树脂3次，将洗好的大孔树脂转移到锥形瓶中，加体积分数75%的乙醇溶液100 mL于30℃恒温振荡箱中解吸附1 h后，经旋转蒸发浓缩和真空干燥，得到酱油渣色素固形物。

1.3.2 酱油渣中色素提取条件单因素试验

取大豆原粒酱油渣100.0 g进行单因素试验，分别在乙醇体积分数为55%、65%、75%、85%、95%，料液比为1∶1.00、1∶1.25、1∶1.50、1∶1.75、1∶2.00（g∶mL），提取时间为4 h、8 h、12 h、24 h、48 h，超声波（超声频率40 kHz，超声功率150 W）辅助提取时间为15 min、20 min、25 min、30 min、35 min条件下，以色素提取效率（采用乙醇提取液在波长400 nm处吸光度值表示）为评价指标，研究上述各因素对酱油渣色素提取效果的影响。

1.3.3 酱油渣中色素提取条件正交试验

在单因素试验的基础上，以乙醇体积分数、料液比、提取时间和超声波辅助提取时间为考察因素，以色素提取效率为评价指标，采用L9（34）正交设计对酱油色素提取条件进行优化，正交试验因素与水平见表1。

表1 酱油渣色素提取工艺优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for extraction technology optimization of melanin in soy sauce residue

1.3.4 酱油渣色素基本成分的测定

总氮：凯氏定氮法[14]；总糖：直接滴定法[14]；氯化钠含量测定：按照GB/T5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》。

1.3.5 酱油渣色素光谱性质

紫外光谱扫描：将纯化后的酱油渣色素用纯水配制成10g/L色素溶液，紫外可见分光光度计在室温下以纯水做矫正，于波长200～1 000 nm范围内进行光谱扫描。红外光谱扫描：酱油色素1mg用100mgKBr压片后在400～4000cm-1进行红外光谱扫描。

1.3.6 酱油渣色素稳定性

本研究酱油色素稳定性以波长400 nm处吸光度变化值表示其变化程度[5]。将酱油色素用纯水配制成10 g/L的色素溶液，分别吸取5mL色素溶液置于多个50mL容量瓶中，用不同的过氧化氢溶液（1%、3%、5%、7%、9%）、亚硫酸钠溶液（0.01 kg/L、0.03 kg/L、0.05 kg/L、0.07 kg/L、0.09 kg/L）、蔗糖溶液（0.05kg/L、0.10kg/L、0.20kg/L、0.30kg/L、0.50kg/L）、山梨酸钾溶液（0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L）、苯甲酸钠溶液（0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L）、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH=3、5、7、8）稀释至刻度后充分混匀，用纯水代替色素溶液，配制相应的参比溶液。室温避光放置1 d、2 d、3d、4d（过氧化氢试验放置1h、2h、3h），磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液实验另做平行组于自然光下放置，测定波长400 nm处吸光度值。分别考察氧化剂、还原剂、糖、防腐剂、pH和光照对酱油色素稳定性的影响。另配制不同浓度的色素溶液，放置于不同温度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）的恒温水浴锅中加热（2 h、4 h、6 h、8 h），冷却后测定波长400 nm处的吸光度值，考察热处理对酱油渣色素稳定性的影响。

1.3.7 高效液相色谱法测定酱油渣乙醇提取液中大豆异黄酮的含量

酱油渣中大豆异黄酮几乎都以三种苷元的形式存在[15]。故本实验以染料木素、大豆苷元、黄豆黄素这三种大豆异黄酮苷元的总和来代表酱油渣大豆异黄酮的总量。

标准品溶液的配制：分别准确称取大豆苷元、染料木素、黄豆黄素标准品适量，用甲醇溶解，配制成质量浓度均为0.08 mg/mL的染料木素、大豆苷元、黄豆黄素混和标准溶液。

样品前处理：取20 mL酱油渣乙醇提取液蒸发浓缩得到浓缩液后加10 mL乙酸乙酯充分振荡分层，取上层溶液40℃旋转蒸发得异黄酮粗品，加20 mL体积分数为75%乙醇溶液后40℃旋转蒸发至无醇味，加10 mL石油醚30℃超声处理30 min进行脱脂，弃去上层石油醚液。加甲醇5 mL，振摇均匀，3 000 r/min离心10 min。上清液用色谱甲醇定容至10 mL，用0.45 μm滤膜过滤，得液相检测样品。

高效液相色谱条件[16-17]：PhenomenexC18色谱柱（250mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.5%乙酸水溶液，梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；柱温：35℃；进样量：50 μL；检测波长：254 nm。

标准曲线：精密量取染料木素、大豆苷元、黄豆黄素混合标准溶液，用甲醇配成质量浓度分别为0.002 mg/mL、0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.040 mg/mL、0.060 mg/mL的混合标准品溶液。分别进样50 μL，以峰面积（Y）为纵坐标，标准品质量浓度（X，mg/mL）为横坐标，分别绘制标准曲线，得到染料木素、大豆苷元及黄豆黄素标准曲线回归方程分别为：Y=6.3766X－9.2992（R2=0.9991）、Y=6.0688X－1.114 1（R2=0.999 0）及Y=1.033 3X－1.242 6（R2=0.998 5）。三种大豆异黄酮苷元在0.002～0.060 mg/mL范围内均呈良好线性关系。大豆异黄酮得率的计算公式如下：

式中：Y为样品的大豆异黄酮得率，mg/100 g；C为液相测得乙醇提取液中三种大豆异黄酮苷元总质量浓度，mg/mL；V为酱油渣经乙醇提取上清液的体积，mL；M为所用酱油渣的质量，g。

2 结果与分析

2.1 酱油渣中色素提取单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对酱油渣中色素提取效果的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，酱油渣提取液吸光度值随之减小，乙醇体积分数在55%～75%之间时，吸光度值变化不大，肉眼几乎看不出其颜色差别。在提取酱油渣的色素过程中综合回收大豆异黄酮，乙醇体积分数过低会导致黄酮等物质的提取率下降，故选取乙醇体积分数75%为宜。

图1 乙醇体积分数对酱油渣色素提取效果的影响Fig.1 Effect of alcohol concentration on extraction effect of melanin in soy sauce residue

2.1.2 料液比对酱油渣中色素提取效果的影响

图2 料液比对酱油渣色素提取效果的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction effect of melanin in soy sauce residue

由图2可知，随着料液比在1∶1.00～1∶2.00（g∶mL）范围内增加，随着料液比的增加，酱油渣提取液吸光度值随之先增大后减小，原因是料液比过大对色素有稀释作用，料液比在1∶1.50（g∶mL）时吸光度值达到最大，故选取料液比1∶1.50（g∶mL）为宜。

2.1.3 提取时间对酱油渣中色素提取效果的影响

图3 提取时间对酱油渣色素提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction effect of melanin in soy sauce residue

由图3可知，随着提取时间在0～50 h范围内增加，酱油渣提取液吸光度值随之增大，提取时间＞24 h后，吸光度值变化趋于缓慢，说明在24 h后色素提取已经基本达到平衡状态。故选取提取时间为24 h为宜。

2.1.4 超声波时间对酱油渣中色素提取效果的影响

图4 超声波时间对酱油渣色素提取效果的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction effect of melanin in soy sauce residue

由图4可知，随着超声波辅助提取时间在15～35 min范围内增加，酱油渣提取液吸光度值随之增大，超声波时间30 min后吸光度值变化趋于缓慢，故选取超声波时间30 min为宜。

2.2 酱油渣中色素提取正交试验

表2 酱油渣色素提取工艺优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for extraction technology optimization of melanin in soy sauce residue

由表2可知，各因素影响提取液中色素含量的主次顺序为A＞C＞B＞D，即乙醇体积分数＞提取时间＞料液比＞超声波时间，由极值R可知，酱油渣中色素提取最优组合为A1B3C3D3，即最佳工艺为乙醇体积分数65%，料液比1∶1.75（g∶mL），提取时间24 h，超声波时间35 min。在此最佳提取条件下，吸光度值A400nm为最大0.541±0.005 7。

2.3 酱油色素基本成分的测定

将经过前面的工艺提取纯化获得的酱油渣色素与原酱油渣中各营养成分进行比较，结果见表3。

表3 酱油渣与其中色素基本营养成分比较Table 3 Comparison of basic nutritional content between soy sauce residue and its melanin

由表3可知，酱油渣中的色素总氮含量比酱油渣中大，而总糖和氯化钠含量很少。这是因为在纯化酱油渣中色素时，经过多次冲洗大孔树脂，可以去掉其中大部分的糖类和盐分，而酱油渣的色素中含有大量的蛋白质、氨基酸、肽等营养物质。

2.4 酱油色素的光谱性质及结构推测

将经过前面的工艺提取纯化获得的酱油渣色素用纯水配制成10g/L色素溶液，紫外可见分光光度计进行光谱扫描。固态酱油渣色素经压片后进行红外光谱扫描，结果见图5。

图5 酱油渣色素紫外(A)及红外(B)吸收光谱图Fig.5 Ultra violet(A)and infrared(B)absorption spectroscopy of soy sauce residue melanin

由图5A可知，酱油色素在400nm紫外波长条件下有最大吸收峰，在波长200～320nm区间有多个小吸收峰，表明色素分子结构中含有C=C－C=C、C=C－C=O、苯环等共轭结构。

由图5B可知，酱油色素在红外一定共振区内有吸收峰，推测其可能具有以下结构：1）-OH和-NH结构，在波数3 400 cm-1附近宽而强的吸收峰是由分子间多聚缔合的O-H和N-H伸缩振动产生；2）-COOH结构，在波数1404cm-1附近吸收峰是O-H变形振动产生，波数1 688 cm-1附近吸收峰是由C=O变形振动产生，与波数3 400 cm-1附近强吸收峰一起，表明含有-COOH结构的存在；3）C=C结构，在波数1517cm-1和1454cm-1附近都存在较强的共振吸收峰，可能由C=C伸缩振动和C-H面内变形振动产生；4）C-O-C结构，波数1 079 cm-1附近吸收峰是由C-O伸缩振动、C-O-C不对称伸缩振动产生；5）-NO2（脂肪族）结构，在波数1 332 cm-1附近存在共振吸收峰，可能是由于-NO2（脂肪族）产生。酱油色素红外光谱图与天然黑色素很相似[18]，紫外和红外光谱特征可推测酱油渣中色素主要由酱油酿造过程中的美拉德反应和酶促褐变生成。

2.5 酱油渣色素的稳定性分析

2.5.1 对氧化剂的稳定性分析

图6 过氧化氢对酱油渣色素稳定性的影响Fig.6 Effect of H2O2on the stability of soy sauce residue melanin

由图6可知，随着过氧化氢含量的增加和反应时间的延长，酱油色素溶液吸光度值逐渐变小，且变化较明显，说明过氧化氢对酱油色素有一定漂白作用，原因是过氧化氢将酱油色素中作为辅色基团的酚羟基氧化，使溶液颜色变浅，甚至褪色。

2.5.2 对还原剂的稳定性分析

图7 亚硫酸钠对酱油渣色素稳定性的影响Fig.7 Effect of Na2SO3on the stability of soy sauce residue melanin

由图7可知，在刚加入亚硫酸钠溶液时，酱油色素溶液吸光度值明显增加，且亚硫酸钠质量浓度越大，吸光度值越大。结果表明，亚硫酸钠对于酱油色素有一定的增色作用，但随着时间的延长，其增色效力下降，而且逐渐被氧化。

2.5.3 对蔗糖的稳定性分析

图8 蔗糖对酱油渣色素稳定性的影响Fig.8 Effect of sucrose on the stability of soy sauce residue melanin

由图8可知，随着蔗糖浓度的增大以及反应时间的延长，酱油色素溶液吸光度值逐渐减小，但变化幅度很小。结果表明，蔗糖对酱油色素稳定性基本没有影响。

2.5.4 对防腐剂的稳定性分析

图9 山梨酸钾(A)及苯甲酸钠(B)对酱油渣色素稳定性的影响Fig.9 Effect of potassium sorbate(A)and sodium benzoate(B)on the stability of soy sauce residue melanin

由图9可知，随着山梨酸钾和苯甲酸钠质量浓度的增大及反应时间的延长，酱油色素溶液吸光度值变化非常小，且感官判别不明显。结果说明，山梨酸钾和苯甲酸钠对酱油色素的稳定性没有影响。

2.5.5 pH、光照、温度对酱油渣色素的影响

图10 自然光条件(A)及避光条件(B)下pH对酱油渣色素稳定性的影响Fig.10 Effect of pH on the stability of soy sauce residue melaninunder natural light(A)and dark(B)condition

由图10可知，避光和自然光条件下，相同pH的酱油色素溶液，吸光度值变化趋势基本无差别，表明光照对酱油色素的稳定性几乎没有影响。pH值在7～8时，酱油色素溶液的吸光度值没有明显变化；pH值在3～5时，吸光度值随时间呈下降趋势。结果表明，在偏酸性环境中，酱油色素的化学性质不稳定。

图11 温度对酱油渣色素稳定性的影响Fig.11 Effect of temperature on the stability of soy sauce residue melanin

由图11可知，温度在50～70℃时，酱油色素能保持较好的稳定性。当温度＞80℃，酱油色素溶液吸光度值出现快速下降，4h后下降趋势缓慢。结果表明，环境温度＞80℃时，酱油色素不稳定。

2.6 提取酱油渣色素过程中综合回收大豆异黄酮的含量测定

应用高效液相色谱法，测定在酱油渣色素提取的最佳工艺条件下所得的乙醇提取液中三种大豆异黄酮苷元的含量，结果见图12。

图12 酱油渣乙醇提取液中大豆异黄酮含量测定的HPLC色谱图Fig.12 HPLC chromatography of soy isoflavones contents determination in alcohol extract of soy sauce residue

由图12可知，通过标准品定性分析，样品中3种大豆异黄酮的出峰顺序依次为染料木素（出峰时间41.5min）、黄豆黄素（出峰时间42.5min）、大豆苷元（出峰时间46.0min），分离度良好。由峰面积归一法定量，可计算样品中染料木素、黄豆黄素、大豆苷元的含量分别为0.081 6 mg/mL、0.097 7 mg/mL、0.015 2 mg/mL，三种苷元总含量为0.194 4 mg/mL。以酱油渣色素提取最佳工艺综合回收大豆异黄酮，每100 g酱油渣中可提取出约37 mg大豆异黄酮。

3结论

应用乙醇溶液和超声波辅助的提取方法，从大豆原粒酱油渣中提取色素，并利用乙酸乙酯萃取回收乙醇提取液中的大豆异黄酮。酱油渣色素粗品经DA201-CⅡ型大孔树脂分离纯化，可制得具有酱香味的褐色酱油色素。研究结果表明，酱油渣中色素的最佳提取工艺为乙醇体积分数65%、料液比1∶1.75（g∶mL）、提取时间24 h、超声波时间35 min，在该条件下酱油渣色素得率约为1.8g/100g；通过高效液相色谱法分析，综合回收可计算样品中染料木素、黄豆黄素、大豆苷元的含量分别为0.081 6 mg/mL、0.097 7 mg/mL、0.015 2 mg/mL，三种苷元总含量为0.194 4 mg/mL，换算成酱油渣中提取大豆异黄酮总得率约为37 mg/100 g。应用紫外和红外光谱分析，酱油渣色素在紫外和红外区间均有非常强的吸收峰。在色素稳定性分析中，酱油渣色素容易被过氧化氢氧化，而亚硫酸钠对其有一定的增色作用；蔗糖、苯甲酸钠、山梨酸钾和光照对酱油渣色素的稳定性影响较小，偏酸性和80℃以上的高温环境对酱油渣色素具有降解作用。

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TS264.21

0254-5071（2017）05-0046-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.010

2017-03-15

广东省省级科技计划项目（2015A010107012）

王帅（1991-），女，硕士研究生，研究方向为酿造调味品。

*通讯作者：朱新贵（1967-），男，副教授，博士，研究方向为酿造调味品。