米曲霉发酵高盐稀态酱油过程中典型挥发性风味物质的形成

童佳，赵国忠*，赵建新，张灏，陈卫

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

米曲霉发酵高盐稀态酱油过程中典型挥发性风味物质的形成

童佳，赵国忠*，赵建新，张灏，陈卫

（江南大学食品学院，江苏无锡214122）

米曲霉是发酵酱油的主要菌种，为了更加具体了解米曲霉发酵酱油过程中典型挥发性风味物质的形成，该研究利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪对沪酿3.042米曲霉单菌种发酵高盐稀态酱油在不同发酵阶段的酱醪进行挥发性风味物质检测，并与12种市售高盐稀态酱油的挥发性风味物质进行对比验证。结果表明，酱醪发酵0～6个月的过程中，醇酚类、酸类物质、酯类物质、含氮化合物含量逐渐增加，挥发性风味物质之间组成比例更加协调，典型的挥发性风味物质包括乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯甲醛、苯乙醛，与市售酱油中典型的挥发性风味物质相同，这些物质保证了酱油风味的相似性。

米曲霉；酱油；风味物质；检测

TONG Jia,ZHAO Guozhong*,ZHAO Jianxin,ZHANG Hao,CHEN Wei
(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

酱油是一种我国传统的发酵食品，距今已有2 000多年的历史，它具有独特的香气、色泽和口感[1]，在人们日常饮食烹调中不可或缺。不同的发酵菌种会影响酱油的风味[2]，米曲霉作为发酵酱油的主要菌种，拥有较全的酶系，能分泌蛋白酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶、果胶酶等[3]，赋予酱油浓烈风味。酱油根据发酵工艺不同主要分低盐固态发酵酱油和高盐稀态发酵酱油，高盐稀态酱油发酵时间长达6个月，风味物质更加丰富[4]，原料麦麸中含有的淀粉和豆粕中含有的蛋白质作为微生物生长的碳源和氮源被酶水解产生醇类、酸类、酯类等构成酱油中独特香气的重要风味物质。酱油中的挥发性风味物质对酱油品质影响极大，但其含量低、成分复杂，且随发酵过程不断变化[5-6]。国内外对酱油中挥发性风味物质成分的研究已有较多报道，但对整个酱油酿造过程中挥发性风味物质含量变化的探究较少。本研究通过气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪检测沪酿3.042米曲霉单菌种发酵高盐稀态酱油过程中不同阶段酱醪的挥发性风味物质和12种不同品牌市售酱油的挥发性风味物质，准确分析发酵酱醪在不同发酵阶段的挥发性风味物质变化情况和典型挥发性风味物质，并与12种不同品牌市售酱油的挥发性风味物质进行对比验证，目的是对米曲霉发酵酱油过程中风味的形成有更细致的了解，对发酵酱油风味和质量的提高有一定积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆粕、麸皮：莱阳市祥原食品有限公司；永川天然豆豉黄酱油、古龙天成两年酱油、酿一村酱油、咸亨母子酱油、先市酱油-晒露、先市酱油-原汁油、杭州湖羊酱油、海天365酱油、海天零添加酱油、海天第一道酱油、鲁花酱油、鲁花原汁酱油：市售，贮藏于4℃条件下待测；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；庚酸甲酯（色谱纯）：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

QP2100单四级杆气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；AB104-N电子天平、PB3002-N分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；85 μm CAR/PDMS固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）头：美国Sigma公司；MJP-1000霉菌培养箱：上海森信实验仪器有限公司；MLS-3750立式压力蒸汽灭菌锅：日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 酱醪酿制

（1）种曲制备

取麸皮与水以10∶11质量比混合，115℃、20 min灭菌。冷却到30～40℃后接种沪酿3.042米曲霉孢子，混匀后30℃条件下堆积培养。当培养基显黄绿色时，28℃条件下培养至全部呈现绿色。将培养物用牛皮纸装袋，50℃条件下烘干，所得为种曲。孢子数为6.72×104个/g，发芽率为96%。

（2）大曲制备

取豆粕与热水以6∶13质量比混合，放置30 min，加入与豆粕同等质量的麸皮，115℃、20 min灭菌。冷却到30～40℃后接入种曲，接种量为0.3%，30℃堆积培养。16 h后表面铺白，翻曲继续培养，8 h后全部铺白，再次翻曲，并于28℃条件下培养，约6 h后大曲呈黄绿色表明已长好。蛋白酶活力定义：40℃条件下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸为1个蛋白酶活力单位（U）。大曲蛋白酶活力达3 642.35 U，水分含量为28.2 g/100 g大曲。

（3）盐水发酵

采用高盐稀态发酵工艺，大曲与质量分数20%的盐水以1∶2质量比混合，15℃条件下发酵，每日升温1℃，直到30℃。发酵时间总计6个月。

1.3.2 挥发性风味物质检测

（1）固相微萃取

常见的萃取头涂层主要分三种：极性涂层，有聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）、聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）等；非极性涂层，有聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）等；中等极性混合涂层，有碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）等[7]。冯云子[8]通过对比PA、CAR/PDMS、DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、PDMS五种萃取头对酱油挥发性风味物质萃取实验发现，CAR/PDMS萃取头对酱油挥发性风味物质萃取效果更好，故本实验采用85 μm CAR/PDMS固相微萃取头进行挥发性风味物质萃取。

精确称取5.000 0 g待测物质于SPME萃取瓶中，加入内标10mg/kg庚酸甲酯5μL。自动进样装置将萃取头插入萃取瓶中，50℃条件下吸附30min，再在250℃条件下解吸3min。

（2）气相色谱分析

采用HP-INNOWax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm），载气为氦气，柱流速1 mL/min，进样口温度为250℃，不分流进样，起始温度40℃，保持5 min，以5℃/min的速度升温至200℃，保持15 min。

（3）质谱分析

采用电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，发射电流200 μA，电子倍增电压350 V，离子源温度200℃，质量扫描范围33～450 amu。

1.3.3 数据处理

将气相色谱-质谱联用仪检测结果通过计算机和人工检索，在NIST Library和Wiley Library库中的已有物质进行匹配定性，匹配度＞80%的物质作为鉴定结果。采用XLSTAT统计分析软件对检测到的风味物质进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 结果与分析

2.1 发酵0～6个月酱醪聚类分析和主成分分析

将高盐稀态条件下发酵0～6个月的酱醪进行GC-MS检测，共检测到206种挥发性风味物质。其中，发酵0、1、2、3、4、5、6个月酱醪中分别含有51、71、86、79、65、80、79种挥发性风味物质。对结果进行聚类分析和主成分（principal component，PCA）分析，得到聚类分析结果见图1和主成分分析结果见图2。

图1 聚类分析树状图Fig.1 Dendrogram of cluster analysis

聚类分析根据样品的差异大小来进行分类。由图1可知，差异大于2391时7个样品可以分为4类：发酵1个月酱醪与发酵2个月酱醪差异最小，与发酵3个月酱醪差异为1020，这三个样品聚为一类；发酵5个月酱醪与发酵6个月酱醪在差异为2 259时聚为一类；差异为2 523时，发酵4个月酱醪单独归为一类；发酵0个月酱醪差异最大，为95 629，归为一类，即酱醪在发酵不同阶段下，发酵0个月的为第一类，发酵1、2、3个月的为第二类，发酵4个月的为第三类，发酵5、6个月的为第四类。其中，发酵0个月的酱醪与其他样品差别最大，表明酱醪是否发酵与挥发性风味物质关系极大；发酵1～3月与发酵4个月酱醪的挥发性风味物质较为接近；发酵5～6个月酱醪之间挥发性风味物质差别较小。可见，随发酵进行，挥发性风味物质有所变化但是变化缓慢。

图2 酱醪主成分分析因子载荷图（a）及因子得分图（b）Fig.2 PCA factor loading graph(a)and factor scoring graph(b)of soy sauce mash

由图2可知，第一主成分（PC1）与第二主成分（PC2）贡献率分别占50.35%和24.24%，累计贡献率达74.59%，包含大部分原始信息，能较好解释原有变量包含的信息。发酵0个月酱醪的特征挥发性风味物质有大量混杂化合物，如（E）-4-苯基-3-丁烯-2-酮（182）、薁（188）、1,3-二甲氧基苯（191），它们不具有特别的风味，此时酱醪还不显酱香。发酵1～3个月酱醪的特征挥发性风味物质包括了2-丁基-1-辛醇（3）、3-庚醇（7），醇类物质作为微生物代谢产物，在酱油发酵前期产生，参与酯化反应。发酵4个月酱醪的特征挥发性风味物质有己二酸（99）、4-甲基戊酸（101），酸类物质主要是由原料分解生产的醇醛氧化而成的，也有部分是微生物代谢产物。发酵5～6个月酱醪的特征挥发性风味物质含有1-丙烯基-2-甲基-2H-吡喃（148）、2-乙酰基-1H-吡咯（157）、2,5-二甲基吡嗪（167）、2,3,5-三甲基吡嗪（171）这些含氮化合物和乙酸-2-癸烯酯（62）、苯乙酸乙酯（73）、丁内酯（77）、十六酸乙酯（79）、己酸乙酯（81）、辛酸乙酯（88）、3-甲基戊酸丁酯（90）这些酯类物质。含氮化合物作为特征挥发性风味物质表明此时原料中的含氮大分子已被大程度地分解为呈味小分子化合物。酯类物质是使酱油风味浓郁柔和的基底物质，能增强其它化合物风味[9]，带来浓郁酱香。2.2发酵0～6个月酱醪分类挥发性风味物质含量变化

发酵酱醪中检测到的206种挥发性风味物质可归类成醇酚类（16种）、酮类（31种）、醛类（14种）、酯类（31种）、酸类（12种）、烷烯炔烃类（29种）、呋喃类（4种）、含硫化合物（7种）、含氮化合物（28种）、混杂化合物（34种）十大类，结果如表1所示。

表1 发酵不同阶段酱醪分类挥发性风味物质含量Table 1 Contents of volatile flavor compounds in soy sauce mash at different fermentation stages mg/g

由表1可知，醇酚类物质、酸类物质、醛类物质、含氮化合物含量在6个月的发酵过程中有大幅度的增长。醇酚类物质、酸类物质在发酵进行时先逐渐增加，后逐渐减少；酯类物质、含氮化合物随发酵进行呈现总体上升趋势。混杂化合物含量在发酵第一个月锐减，且随着发酵进行，在含量上并没有大的变化。发酵0个月是样品挥发性风味物质含量最多的时间段，以混杂化合物为主，约占总量的55%，可见制曲阶段是挥发性风味物质含量最高的时候。发酵1～3个月的酱醪以醇酚类、醛类为主，发酵4个月的酱醪以醇酚类、酸类、醛类为主，发酵5～6个月的酱醪以醇酚类、酸类、酯类、含氮化合物为主。随酱醪发酵的进行，酱醪酯类、醛类、酸类、醇酚类、含氮化合物明显增加，挥发性风味物质种类整体呈现上升趋势，赋予酱醪浓郁香气，相比于大曲阶段，组成比例更加协调。

2.3 发酵0～6个月酱醪重要挥发性风味物质分析

酱醪发酵过程中，挥发性风味物质种类繁多、变化情况复杂，但有部分挥发性风味物质是多数不同阶段发酵酱醪所共有的且含量较高，是酱醪发酵重要的挥发性风味物质。重要的挥发性风味物质在酱醪发酵过程中的含量变化情况结果见表2。

表2 发酵不同阶段酱醪重要挥发性风味物质含量Table 2 Contents of important volatile flavor compounds in soy sauce mash at different fermentation stages mg/g

续表mg/g

由表2可知，重要的挥发性风味物质中，乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯甲醛、苯乙醛含量较高，是典型的挥发性风味物质。乙醇平均含量是样品中最高的，随发酵进行呈先递增后递减的趋势。醇类物质多具有花草香气[10]，能与酸类物质发生酯化反应。酱醪中酸类物质以乙酸、3-甲基丁酸含量居多，乙酸具有刺激性气味，但能舒缓酱油咸味[11]，调和香气，并在发酵过程中与醇类物质作用产生酯类，增强酱油风味[12]，3-甲基丁酸在苹果、草莓等食品中均有存在，被应用于各种食用香精的配制，各种酸类物质在酱醪中起到相互协调的作用[13]。酯类物质在发酵过程中含量递增，是构成酱油香气的主体，有苯乙酸乙酯、十六酸乙酯等，苯乙酸乙酯具有浓烈的蜂蜜香味，十六酸乙酯具有典型的果香味，天然存在于菠萝、杏之中。酯类物质是发酵食品中特征性香气化合物[14]，含量较高且丰富，赋予酱油丰厚浓郁的风味。吡嗪类物质有2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪，含量随发酵进行递增，香气强烈具有透散性[15]，赋予酱醪烘烤风味。苯甲醛和苯乙醛含量均较高，与3-甲基丁醇、3-甲基丁酸、3-甲基丁醛等物质均为氨基酸代谢产物，苯甲醛具有杏仁香，苯乙醛具有蜂蜜香[16]，为酱醪风味增添丰厚感。

2.4 市售酱油分类挥发性风味物质含量

对12种市售成品酱油进行GC-MS检测，共检测到413种挥发性风味物质。其中，醇酚类38种、酮类34种、醛类23种、酯类77种、酸类24种、烷烯炔烃类61种、呋喃类7种、含硫化合物7种、含氮化合物37种、混杂化合物105种。永川天然豆豉黄酱油含有挥发性风味物质127种、古龙天成两年酱油含有挥发性风味物质82种、酿一村酱油含有挥发性风味物质100种、咸亨母子酱油含有挥发性风味物质137种、先市酱油-晒露含有挥发性风味物质81种、先市酱油-原汁油含有挥发性风味物质95种、杭州湖羊酱油含有挥发性风味物质83种、海天365酱油含有挥发性风味物质89种、海天零添加酱油含有挥发性风味物质89种、海天第一道酱油含有挥发性风味物质89种、鲁花酱油含有挥发性风味物质57种、鲁花原汁酱油含有挥发性风味物质41种。将分类挥发性风味物质含量对应不同市售酱油进行汇总，结果如表3所示。

由表3可知，不同市售酱油的主要分类物质有所不同，含量也不同。整体而言，醇酚类、酯类、酸类为最主要的三类挥发性风味物质。其中，醇酚类为永川天然豆豉黄酱油、古龙天成两年酱油、杭州湖羊酱油、海天365酱油、海天零添加酱油、海天第一道酱油、鲁花原汁酱油最主要的分类物质，分别占总挥发性风味物质含量的42.00%、32.19%、74.53%、78.40%、78.46%、77.14%、81.02%。酯类为咸亨母子酱油、鲁花酱油最主要的分类物质，分别占总挥发性风味物质含量的22.22%、22.60%。酸类为酿一村酱油、先市酱油-晒露、先市酱油-原汁油最主要的分类物质，分别占总挥发性风味物质含量的26.22%、63.01%、27.59%。这与酱醪发酵6个月时主要的挥发性风味物质含量情况相符，醇酚类、酸类、酯类是酱油中重要的挥发性风味物质组成，各类物质之间的相互协调对酱油风味形成具有重要贡献[17]。

表312 种市售酱油分类挥发性风味物质含量Table 3 Contents of volatile flavor compounds in 12 kinds of commercial soy sauces mg/g

2.5 市售酱油重要挥发性风味物质分析

表412 种市售酱油重要挥发性风味物质含量Table 4 Contents of important volatile flavor compounds in 12 kinds of commercial soy sauces mg/g

续表mg/g

由表4可知，虽然12种市售酱油因酿造原料、工艺条件风味物质各有不同，但有55种挥发性风味物质是多数市售酱油共有的，这些物质包括3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、乙醇、苯甲醛、苯乙醛、2-甲基正丁醛、3-甲基正丁醛、乙酸、二甲基二硫等，对酱油香气有重要贡献[18]。与发酵酱醪一样，乙醇平均含量最高，它是微生物利用糖和氨基酸的代谢产物。乙酸平均含量第二高，是发酵制品的重要化合物。苯甲醛、苯乙醛、2-甲基-正丁醛、3-甲基-正丁醛检出含量较高，醛类物质具有甜香、果香等令人愉悦的香气，可与醇类物质缩合，产生其他风味物质，种类越多，风味越丰富，它们是提高酱油风味的重要物质。共有的吡嗪类化合物种类较多，有3-甲基-2-丁基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪，它们具有烘烤香气[19]。酯类物质是重要的风味化合物，共有的酯类包括苯乙酸乙酯、十六酸乙酯等，不同酯类混合使酱油风味浓厚。这些共有的重要挥发性风味物质中，乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯甲醛、苯乙醛也是发酵酱醪中共有的，是典型的挥发性风味物质，保证了酱油风味的相似性。

3 结论

通过对沪酿3.042米曲霉单菌种发酵高盐稀态酱油发酵6个月过程中酱醪挥发性风味物质变化和12种市售酱油挥发性风味物质检测分析，发现酱醪在发酵0～6个月的过程中，发酵前期，酱醪以醇酚类、醛类为主；发酵中期，酱醪以醇酚类、酸类、醛类为主；发酵后期，酱醪以醇酚类、酸类、酯类、含氮化合物为主。其中，乙醇、乙酸、3-甲基丁酸、苯乙酸乙酯、十六酸乙酯、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯甲醛和苯乙醛是重要的挥发性风味物质组成，与12种市售酱油重要的挥发性风味物质成分情况相符，使酱油具有相似的风味。

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TS262.2

0254-5071（2017）05-0022-08

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.006

2017-02-22

国家自然科学基金青年基金项目（31401682）；江苏省自然科学基金青年基金项目（BK20140146）

童佳(1992-)，女，硕士研究生，研究方向为食品微生物学。

*通讯作者：赵国忠（1983-），男，副教授，博士，研究方向为功能食品微生物学。