次声对大鼠海马区钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ及Tau蛋白表达的影响

蔡丽，王晋，崔尧，张鸽，武松艳，张文东，刘朝晖

次声对大鼠海马区钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ及Tau蛋白表达的影响

蔡丽1，王晋2，崔尧3,4，张鸽2，武松艳1，张文东1，刘朝晖1

目的探讨8 Hz、130 dB次声对大鼠海马区钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)及tau蛋白表达的影响。方法56只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组(n=8)、1 d组(n=8)、7 d组(n=8)、14 d组(n=32)。14 d组再分为照射后1 h、6 h、24 h、48 h亚组，每亚组8只。对照组每天次声仓内无次声作用放置2 h，其余各组8 Hz、130 dB次声照射2 h。免疫组织化学、Western blotting和ELISA方法检测各组大鼠海马区磷酸化CaMKⅡ(pT286-CaMKⅡ)及tau蛋白表达。结果14 d组pT286-CaMKⅡ水平最高(F> 14.912,P<0.001)，tau蛋白表达最多(F>36.229,P<0.001)，7 d组次之(P<0.05)。14 d组中，次声后1 h、6 h，tau蛋白表达最高，24 h有所恢复，但仍较对照组高(P<0.05)。结论8 Hz、130 dB次声作用后，大鼠海马区CaMKⅡ磷酸化水平和tau蛋白表达及磷酸化水平增高，可能参与次声致大鼠学习记忆功能受损。

次声；钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ；tau蛋白；学习记忆；海马；大鼠

[本文著录格式]蔡丽，王晋，崔尧，等.次声对大鼠海马区钙调依赖性蛋白激酶Ⅱ及Tau蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践,2017,23(3):298-303.

CITED AS:Cai L,Wang J,Cui Y,et al.Effects of infrasound on expression of calmodulin-dependent protein kinase II and tau protein in hippocampus of rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):298-303.

次声波是一种频率<20 Hz，处在人耳可听范围之外的声波，自然界运动(地震、海啸、火山爆发等)和人类生产生活活动(船舶发动、火箭发射、载人航天飞船等)都可产生次声波[1]，严重威胁宇航员及相关职业人员的身心健康。

次声波主要通过生物共振的方式对生物体各个器官和组织产生影响。已知人脑的固有频率为8 Hz左右，当次声频率接近8 Hz时，会对人的中枢神经系统(central nervous system,CNS)产生影响。关于次声对CNS的作用机制研究已涉及不同层面，包括神经元凋亡、氧化应激损伤、轴突变性、谷氨酸代谢、海马超微结构、血脑屏障和脑血管、齿状回神经前体细胞增殖、学习记忆、胶质细胞活化和神经系统炎症反应、TRPV4在次声损伤中的作用等[2-14]。

tau蛋白是一种微管相关蛋白(microtubule-associated proteins,MAPs)，属于含磷蛋白质，主要分布于大脑的额叶、海马及内嗅区，外周神经系统的含量也较丰富，而小脑中一般分布较少[15]。其正常生理功能是诱导与促进微管蛋白合成微管，并与之结合以维持微管结构和功能的稳定及微管解离，诱导微管成束并促进囊泡运输等物质转运。tau蛋白的过度磷酸化会影响微管稳定性，改变其正常结构，造成神经元间信息传递受阻，进而发展成神经元退行性变和认知障碍[16]。

我们在前期研究中发现，8 Hz、130 dB次声作用一定时间可以导致大鼠海马区Ca2+浓度改变[17]。本研究中观察8 Hz、130 dB次声作用下，大鼠海马细胞内钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)和tau蛋白的表达及其变化规律，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1主要仪器与材料

次声压力舱及次声信号检测系统：第四军医大学研制。全自动组织脱水机、组织包埋机、低温恒冷切片机和LEICA LA型全自动光学显微镜：LEICA公司。鼠抗免疫组化试剂盒、鼠抗tau多克隆抗体、辣根过氧化标记的鼠二抗：武汉博士德公司。鼠抗tau单克隆抗体：ABCAM公司。CaMKⅡ苏氨酸-286位点磷酸化(pT286-CaMKⅡ)多克隆鼠抗体：PROMEGA公司)。tau蛋白磷酸化(pSer262-tau)蛋白ELISA试剂盒：ELABSCIENCE公司。

1.2模型制备

健康雄性成年Sprague-Dawley大鼠56只(第四军医大学实验动物中心提供)，体质量180~220 g，饲养于安静环境下(基础噪音≤40 dB)，自由饮水，标准饲料喂养。将大鼠编号，随机数字表法将大鼠随机分组。暴露于8 Hz、130 dB次声中，每天2 h，按暴露时间分为对照组、1 d组、7 d组、14 d组共4组(对照组在次声仓内无次声放置2 h)。对照组、1 d组、7 d组每组8只；14 d组32只，再分为照射后1 h、6 h、24 h、48 h共4个亚组(n=8)。

1.3检测方法

1.3.1免疫组织化学染色

按预定时间取各时点大鼠，1 d组、7 d组、14 d组照射后1 h内完成灌注取材，14 d组剩下动物按预定作用后不同时间取材。各组随机取4只大鼠，1%戊巴比妥钠20 mg/kg腹腔注射麻醉，生理盐水心内灌注至肝发白(约30 min)，换用4℃4%多聚甲醛心内灌注30~40 min(即刻出现肢体与尾部的抖动)，触摸肝组织较硬时，停止灌注。剥离脑组织，置4%多聚甲醛固定24 h；冠状切片，厚30 μm左右，放入组织包埋盒中，流动水冲洗2 h；全自动组织脱水机中脱水，石蜡包埋。切片机切成组织薄片(厚3 μm)。加pT286-CaMKⅡ多克隆鼠抗(1∶100)和tau单克隆抗体(1∶100)，SAB三步法行免疫组化染色。

LEICA LA型全自动光学显微镜放大400倍观察，1392×1040像素扫描(图像分析软件Simple PCI 5.2)并存档。每个标本随机取4张切片，每张切片在海马细胞层随机取3处面积相同的pT286-CaMKⅡ及tau蛋白阳性表达区域测灰度值，取平均值；再以分子层做被底，随机取3处相同面积区域测灰度值，取平均值；用被底灰度值减去pT286-CaMKⅡ及tau蛋白阳性表达区域的灰度值，得到阳性表达细胞的相对灰度值。每个标本4张切片测得的相对灰度值再取平均值。

1.3.2Western blotting

各组另4只大鼠断头活杀，碘酒、乙醇及生理盐水清洗后，无菌条件下5 min内剥出双侧海马区组织，迅速放入液氮罐内冻存。

BCA法测定蛋白浓度。取预染蛋白Marker 3 μl和蛋白30 μg相对应的体积上样，进行0.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶80 V电泳30 min左右，待出现明显条带时，转换为140 V电压电泳约1 h。将目的蛋白转移到PVDF膜上(300 mA,2 h)；室温下用含0.05 BSA的TBST封闭1.5 h；TBST反复冲洗5次，每次5 min；加入鼠抗tau(1∶1000)、鼠抗β-actin(1∶1000)一抗，4℃冰箱过夜。TBST反复冲洗5次，每次5 min，加入相应的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶2000)，室温下孵育2 h。ECL显色，电泳凝胶成像分析仪采集结果。取目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之比。

1.3.3ELISA

取冻存的海马组织，预冷PBS冲洗组织上血液，按1∶9提取组织上清液行pSer262-tau ELISA检测。每孔加入标准品和待测样品100 μl，酶标板覆膜，37℃孵育90 min；弃去液体，甩干，每孔加入生物素化抗体工作夜100 μl(使用前15 min内配置)，酶标板覆膜，37℃温育1 h；弃去液体，甩干，洗板3次；每孔加入酶结合工作液100 μl(使用前15 min内配置)，覆膜，37℃温育30 min；弃去液体，甩干，洗板5次；每孔加入底物溶液(TMB)90 μl，酶标板覆膜，37℃避光孵育15 min左右(根据实际显色情况酌情缩短或延长，当标准孔出现明显梯度时即终止)；每孔加入终止液50 μl，终止液加入顺序应与底物溶液加入顺序一致；立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔光密度(optical density,OD)。依据标准蛋白浓度梯度得到相应公式，将各组待测蛋白的OD代入公式，得到pS-er262-tau蛋白浓度。

1.4统计学分析

2 结果

2.1免疫组织化学染色

8 Hz、130 dB次声照射后，大鼠海马各亚区(CA1、CA3、DG)均以14 d组pT286-CaMKI及tau蛋白表达最多(P<0.01)。7 d组pT286-CaMKⅡ在CA3区与1 d组和对照组有非常显著性差异(P<0.01)，其他区域无显著性差异(P>0.05)。7 d组tau蛋白在各区均与1 d组和对照组有显著性差异(P<0.05)。

14 d组内，各区pT286-CaMKⅡ和tau蛋白表达均在照射后1 h和6 h最高，24 h后有所恢复，但仍较对照组、1 d组、7 d组高(P<0.05)。

见表1~表4，图1~图2。

表1 各组海马pT286-CaMKⅡ水平(相对灰度)

表2 14 d组各亚组海马pT286-CaMKⅡ水平(相对灰度)

表3 各组海马tau蛋白水平(相对灰度)

表4 14 d组各亚组海马tau蛋白水平(相对灰度)

图1 次声照射不同时间大鼠海马区tau蛋白表达(免疫组化染色，200×)

图2 次声照射14 d后不同时间大鼠海马区tau蛋白表达(免疫组化染色，200×)

2.2Western blotting

随次声照射时间延长，大鼠海马区tau蛋白表达增加，各组间均有显著性差异(P<0.05)。见表5。

14 d组内，tau蛋白表达以照射后1 h和6 h最高，24 h有所恢复，但仍高于对照组(P<0.05)。见表6。

2.3ELISA

大鼠海马区pSer262-tau蛋白表达14 d组最高(P< 0.01)，其次为7 d组(P<0.05)，1 d组与对照组间无显著性差异(P>0.05)。见表5。

14 d组内，pSer262-tau蛋白表达在照射后1 h和6 h最高，24 h有所恢复，但仍高于对照组(P<0.05)。见表6。

表5 各组海马区tau蛋白及pSer262-tau蛋白表达

表6 14 d组各亚组海马区tau蛋白及pSer262-tau蛋白表达

3 讨论

tau蛋白作为神经元骨架蛋白之一，广泛存在于神经元胞体及其轴突中，在维持微管结构和功能的稳定性中起重要作用。1975年，Cleveland等首次发现tau蛋白在与微管绑定时会发生磷酸化。tau蛋白的过度磷酸化可以通过降低tau对微管的亲和力、消耗正常tau蛋白和微管相关蛋白，影响微管稳定性，改变微管的正常结构，使之转变为成对螺旋丝(paired helical filaments,PHFs)，并以纤维丝团形式堆积在神经元内，形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)，从而使轴浆运输紊乱，神经递质的运输、释放和重摄取异常，造成神经元间信息传递受阻，最终发展成神经元退行性变和认知障碍[18]。

一定频率和声压级的次声暴露，可以损伤动物的学习记忆功能，减少海马的神经发生，引起神经元轴突变形，并随声压级增高而加重。有研究表明，8 Hz、130 dB次声波作用后，大鼠海马DG区具有增殖能力的前体细胞数目明显下降，水迷宫检测的空间认知能力明显受损[19]。

本研究显示，8 Hz、130 dB次声作用下，大鼠海马tau蛋白水平及其磷酸化水平均随照射时间延长而增加，这与前期实验发现次声作用后大鼠海马区Ca2+浓度升高的时间一致。

CNS中的Ca2+主要作用于轴突的生长，影响正在发育中的神经元的神经分泌活动，神经介质受体蛋白植入细胞膜，以及突触传递；还可以调节神经元的存活、神经元树突和轴突结构发育及突触可塑性，影响神经元回路的形成及学习、记忆等过程。利用钙成像技术观察发现，随着次声波的声压级和刺激时间增长，海马区细胞内Ca2+浓度明显升高，海马区神经元凋亡增多；神经元的凋亡增加时间与海马细胞内Ca2+升高的时间一致[20-21]。这提示海马细胞内Ca2+浓度异常增高或超载在次声所致神经细胞结构和/或功能损伤中可能是一个关键因素。

已知CaMKⅡ是一种较大型具有10个亚单位的酶，是脑内含量最丰富的蛋白激酶，在海马和新皮层的突触后神经元致密层密度最高。该酶的特点是Ca2+依赖的自动磷酸化：当它被Ca2+激活后即进入一种活动状态，此时即使去除Ca2+仍能保持其活性，包括自动磷酸化[22]。本研究显示，8 Hz、130 dB次声作用后，大鼠海马区CaMKⅡ磷酸化水平普遍增高，tau蛋白磷酸化过程也明显增强。

在CNS中，tau蛋白含有多个磷酸化位点，可被多种脯氨酸蛋白激酶和非脯氨酸蛋白激酶催化磷酸化反应。其中CaMKⅡ、糖原合成酶激酶3等被认为是脑内调节tau蛋白磷酸化最重要的蛋白激酶，也是近年来的研究热点[23]。我们推测，次声波可能通过调节CaMKⅡ磷酸化，干扰tau蛋白的正常功能。

体外实验也证实，CaMKⅡ可以使tau蛋白Ser262~Ser356等多个位点磷酸化，这些位点的磷酸化会促进与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)发生密切相关的NFTs形成[24]。AD患者多表现为学习记忆等认知障碍。免疫组织化学染色法检测AD动物海马CA1区CaMKⅡα与过度磷酸化的tau蛋白共存，且CaMKⅡα的免疫阳性反应多集中于海马区老年斑，提示CaMKⅡα可能参与tau蛋白的过度磷酸化和老年斑的形成[25]。

综上所述，我们推测8 Hz、130 dB次声可能通过Ca2+-CaMKⅡ-tau蛋白途径介导神经退行性变及认知障碍。应用Ca2+拮抗剂是否有助于对次声引起的脑功能损害进行防护，仍需要进一步研究。

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Effects of Infrasound on Expression of Calmodulin-dependent Protein Kinase II and Tau Protein in Hippocampus of Rats

CAI Li1,WANG Jin2,CUI Yao3,4,ZHANG Ge2,WU Song-yan1,ZHANG Wen-dong1,LIU Zhao-hui1
1.Department of Rehabilitation Medicine,Tangdu Hospital,the Fourth Military Medicine University,Xi'an, Shaanxi 710038,China;2.Section of Radiation Medicine Teaching&Research,the Fourth Military Medicine University,Xi'an,Shaanxi 710032,China;3.Beijing Bo'ai Hospital,China Rehabilitation Research Center,Beijing 100068,China;4.Capital Medical University School of Rehabilitation Medicine,Beijing 100068,China

LIU Zhao-hui.E-mail:15829845741@163.com

ObjectiveTo study the effect of infrasound on expression of calmodulin-dependent protein kinase II(CaMKII)and tau protein in hippocampus of rats.MethodsFifty-six male Sprague-Dawley rats were randomized into control group(n=8),1-day group(n=8), 7-day group(n=8)and 14-day group(n=32),and the 14-day group was subgrouped as 1-hour,6-hour,24-hour,48-hour subgroups,naming after the time after infrasound exposure,8 in each subgroup.All the test groups were put in an infrasound field with 8 Hz,130 dB for 2 hours daily,while the control group was put in the infrasound instrument without infrasound exposure for 2 hours daily.The expression of pT286-CaMKII and tau protein in hippocampus was detected with immunohistochemisty,Western blotting and enzyme-linked immunoabsorbent assay.ResultsThe expression of pT286-CaMKII was the most in 14-day group(F>14.912,P<0.001),as well as the expression of tau protein(F>36.229,P<0.001),and secondary in 7-day group(P<0.05).For 14-day group,the expression of tau protein was the most in 1-hour and 6-hour subgroups,and dropped down in 24-hour subgroup,although more than that in the control group(P<0.05).ConclusionExposure of 8 Hz,130 dB infrasound may induce phosphorylation of CaMKII and tau protein,and the expression of tau protein in hippocampal cells in rat,which may disturb their learning and memory function.

infrasound;calmodulin-dependent protein kinase II;tau protein;learning and memory;hippocampus;rats

R594.9

A

1006-9771(2017)03-0298-06

2016-10-26

2017-01-04)

国家自然科学基金项目(No.31470825)。

1.第四军医大学唐都医院康复医学科，陕西西安市710038；2.第四军医大学放射医学教研室，陕西西安市710032；3.中国康复研究中心北京博爱医院，北京市100068；4.首都医科大学康复医学院，北京市100068。作者简介：蔡丽(1987-)，女，汉族，陕西商南县人，硕士研究生，治疗师，主要研究方向：言语认知功能障碍的治疗及其机制。通讯作者：刘朝晖(1962-)，女，汉族，山西运城市人，博士，副主任医师，硕士研究生导师，主要研究方向：物理治疗的临床应用与机制研究。E-mail:15829845741@163.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.010