水稻 玆SSG58 的进化分析及其拟南芥同源基因 ATG58 的组织表达模式

于东明 李筱雨 孙申领 孙炎锋 王伟 吕东 苗琛

摘要 [目的]查找水稻 RSSG58 在拟南芥中的同源基因并观察其组织表达模式。[方法]利用相关基因信息学网站构建水稻 RSSG58 的基因进化树，构建其同源基因 ATG58：：GUS定位载体转入拟南芥，观察分析ATG58 的组织表达模式。 [结果]进化树和序列对比发现ATG58与RSSG58 具有较高的序列相似性，GUS定位遗传材料显示 ATG58在多种组织都有表达，在生长发育早期的根、子叶、下胚轴、胚芽表达量相对较高，在生殖发育阶段的花苞和花药内优势表达，ATG58与RSSG58具有相似的GUS 定位组织表达模式。[结论] ATG58 是水稻 RSSG58 的同源基因，二者组织表达模式一致，这些结果为深入研究拟南芥 ATG58 和水稻 RSSG58 在雄配子发育过程中的作用及机制提供了基础资料。

关键词水稻；RSSG58；ATG58；β-葡萄糖苷酸酶（GUS）；组织表达；进化树分析

中图分类号S501文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）10-0126-03

Evolutionary Analysis of Rice RSSG58 and Tissue Expression Pattern Analysis of Its Arabidopsis Homologous Gene ATG58

YU Dongming，LI Xiaoyu，SUN Shenling，MIAO Chen* et al（Henan Provincial Key Laboratory of Plant Stress Biology，State Key Laboratory of Cotton Biology ，Henan University，Kaifeng，Henan 475001）

Abstract[Objective] To find the homologous gene of rice RSSG58 in Arabidopsis thaliana and observe its tissue expression pattern.[Method] The phylogenetic tree of rice RSSG58 was constructed by using the related gene informatics website.The homologous gene ATG58：：GUS locus was constructed into A.thaliana to observe and analyze the tissue expression pattern of ATG58.[Result] The phylogenetic tree analysis and sequence comparison showed that ATG58 had a highest sequence similarity with RSSG58.GUS locating genetic material showed that ATG58 was expressed in various tissues.The expression of ATG58 was relatively higher in root，cotyledon，hypocotyl and embryo of seedling stage，and it was superior to the buds and anthers in the reproductive development stage.ATG58 had similar GUS localization expression pattern with RSSG58.[Conclusion] ATG58 is the homologous gene of rice RSSG58，which is consistent with RSSG58 in the tissue expression pattern.These results provide a basis for further study of the role and mechanism of A.thaliana ATG58 and rice RSSG58 in the development of male gametes.

Key wordsOryza saliva L；RSSG58；ATG58；Betaglucuronidase（GUS）；Tissues expression；Phylogenetic tree analysis

水稻（Oryza saliva L）是一種重要的粮食作物，由于它具有较小的基因组（430 Mb），以及与其他禾本科植物较高的共线性，已经成为研究植物发育生物学和功能基因的重要单子叶模式生物[1]。模式植物水稻和拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组测序工作的完成为植物基因功能的研究提供了极大的便利。双受精作用是被子植物自然分类群的独有特征，精细胞（Sperm cells）在被子植物生殖发育过程中担负着受精、识别以及遗传物质传递等重要使命。前期已成功地分离出了批量的水稻生活精细胞[2]，并用抑制差减杂交（SSH）技术从水稻精细胞文库中筛选到一些在精细胞中表达的基因[3-4]。其中

RSSG58 基因在精细胞中优势表达，且其推测蛋白与拟南芥的肌球重链蛋白同源性较高，相关的研究也暗示了其可能在精细胞发育和受精过程中起关键作用。

笔者首先通过基因信息学分析找到水稻 RSSG58 的拟南芥同源基因 ATG58，并构建GUS 组织表达遗传材料，观察了 ATG58在不同组织的表达模式，以期为深入研究水稻 RSSG58 及其拟南芥同源基因 ATG58 在雄配子发育过程中的作用及机制提供有价值的线索。

1材料与方法

1.1植物材料和培养

培养材料：拟南芥生态型植株 Columbia（Col-0），种子由河南省植物逆境生物学重点实验室提供。拟南芥生长室培养条件为温度约 22 ℃；光周期为 16 h 光照，8 h 黑暗。1/2 MS 培养基：MS 盐 2.2 g/L、3% 蔗糖和灭菌蒸馏水，调 pH 到 5.9～6.1，加入 1.5% 琼脂粉，摇匀后高压锅内灭菌，在超净台内倒板。拟南芥的培养：取适量新鲜拟南芥种子，18%次氯酸钠处理 10 min，无菌水清洗 3～4 次，点种于预先配制好的 1/2 MS 培养基上。

1.2质粒、菌株、试剂和仪器

pEASY-Blunt 克隆载体购自全式金生物技术有限公司（北京）；表达载体 GUS-pCAMBIA1391 由河南省植物逆境生物学重点实验室提供。大肠杆菌感受态菌株 Trans1-T1 购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌 GV3101 由河南省植物逆境生物学重点实验室提供。限制性内切酶购于 TaKaRa 中国分公司（大连）；聚合酶链式反应（PCR）试剂购自天根生化科技有限公司（北京）；DNA 提取试剂盒购自TaKaRa 中国分公司（大连）；常规化学试剂购自北京化工厂（北京）；引物合成和 DNA 测序主要由金唯智生物科技（北京）有限公司完成（北京）。主要仪器有显微镜（Olympus BX51，日本）、PCR仪（BIO-RAD C1000，美国）和数码照相机（佳能 60D，日本）。

1.3拟南芥基因组 DNA 的提取

剪取 1～2 片比较幼嫩的拟南芥叶片并用双蒸水洗净后放入 1.5 mL 的 EP 管中，加入液氮速冻，用研磨棒研磨充分，使用 DNA 提取试剂盒提取 DNA，晾干，取 30 μL无菌水加入离心管中，使 DNA 充分溶解，离心收集 DNA，-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4基因克隆和载体构建

组织定位载体构建：将 ATG58 基因的 1 610 bp 启动子序列采用 Primer Premier 5.0 软件设计两端带有 Pst Ⅰ 和BamH Ⅰ 酶切点的引物，将目的基因片段连接到表达载体 GUS-pCAMBIA1391 中，构建融合蛋白表达载体 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391。

1.5进化树分析

利用 Clustal X 和 GeneDoc 进行氨基酸序列比对及同源性分析；利用 http：//www.arabidopsis.org/ 网站提供的 BLAST 程序，把水稻 RSSG58 的蛋白序列输入进去，比对分析基因的拷贝数；进化树采用 Clustal Omega 网站 http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ 在线获得。

1.6农杆菌浸花转化法转染拟南芥

把 10 μL ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 质粒加入到 100 μL 农杆菌感受态 GV3101 菌液中，冻融法进行转化；挑取农杆菌单菌落分别置于含卡那霉素和利福平抗生素的 YEB 液体培养基中，于摇床中 28 ℃ 200 r/min 过夜摇培 20～24 h；取摇好的菌液进行 PCR 检测。取 PCR 验证的上述农杆菌单菌液至 30 mL 新鲜的含有抗生素的 YEP 培养液中，振荡培养，至 OD600=1.2～1.6，5 000 r/min 离心 10 min，收集菌体。重悬于渗入缓冲液（0.5 MS、5%蔗糖、0.03% Silwet L-77），调 OD600 至 0.8。待拟南芥Columbia生态型（Col-0）植株生长至开花期，把配好的农杆菌转化液倒进一个大培养皿中，淹没材料浸染 30～40 s，然后用保鲜膜包盘，水平放置，室温避光放置 24 h 后，正常置于材料室。

1.7β-葡萄糖苷酸酶（GUS）组织化学分析

将 ATG58：：GUS 转基因植株的不同组织分别置入配制好的GUS染色液中（调pH=7.2），37 ℃ 保温过夜。将染色好的植物组织置于固定液（乙醇∶乙酸=3∶1）中固定脱色 2 h，然后用透明剂进行透明处理，将透明好的植物材料置于显微镜下观察和拍照。

2結果与分析

2.1RSSG58 进化树分析

首先利用水稻相关网站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml）获得水稻 RSSG58 的基因号（LOC_Os12g41810）和蛋白序列，利用拟南芥 Tair 网站 BLAST 工具， 输入 RSSG58 蛋白序列，WU-BLAST[5-6]查找其在拟南芥的同源蛋白。根据P值选取相关基因建立 NJ 树（图 1），这个系统发育关系总体是合理的，支系间支持率都大于 50，所以基因间关系是可信的。从进化树结果分析拟南芥 At2g34730（称为 ATG58）与 RSSG58 同属一支，具有最高的相似度，并且二者序列有较高的相似度（图 2）。综合相关基因信息学分析显示：拟南芥 ATG58 可能与水稻 RSSG58 有着相同或相近的生物学功能。

2.2ATG58 的 GUS 组织定位表达载体构建在目的基因 ATG58 的启动子后连上 GUS 基因作为报道基因，通过其组织定位情况来研究目的基因的表达情况[7]，以便更好地分析目的基因的功能。为了检测目的基因 ATG58 的组织表达情况，该研究构建了 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 载体（图3），以野生型拟南芥基因组 DNA 为模板扩增目的基因的启动子，回收后的基因与 GUS-pCAMBIA1391 空质粒进行双酶切及连接，然后转化大肠杆菌感受态，过夜培养后挑取单菌落进行 PCR 验证。经双酶切验证鉴定插入片段与质粒 PCR 片段大小一致（图4），测序结果显示正确。表明 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 载体构建成功。

2.3ATG58的组织表达模式

把 ATG58 Pro：：GUS-pCAMBIA1391 载体通过农杆菌转化到野生型植株中产生了稳定的转基因株系。对 T3 代转基因纯合株系的不同组织进行 GUS 染色，結果发现，ATG58 基因在多种组织都有表达，生长发育早期的根、子叶、下胚轴、胚芽表达量相对较高，生殖发育阶段的花苞、花药以及雄蕊表达量较高，属于优势表达。

3讨论与结论

植物雄性不育（Male sterility，MS）作为杂种优势利用的基础，其遗传机制一直受到水稻育种学家的高度重视，目前，已对有关雄性不育分子机制提出了相应的理论和假设[8-10]。迄今为止人们对植物生殖发育过程的了解与认识，远远不能满足植物雄性不育的理论和杂种优势利用的需要，利用现代生物学技术诱导表达雄性不育基因是创造雄性不育系的有效途径之一[11]。

前期发现 RSSG58 在精细胞中优势表达，其花粉发育过程出现异常[3-4]，深入研究将有利于解析植物雄性不育的相关机制。通过水稻 RSSG58 的基因信息学分析，在拟南芥中找到一个同源性较高的基因 ATG58，二者蛋白序列有较高的相似性。

生物信息学分析显示 RSSG58 基因在第12开花期的雄蕊、花粉粒、幼苗期根、成熟叶片等部位表达量明显较高（Rice eFP Browser，http：//bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi），但是该网站（Arabidopsis eFP Browsers，http：//bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）缺乏其同源基因 ATG58 的相关组织表达信息。拟南芥作为常用的模式植物，具有比水稻生长周期短、构建遗传材料快等优点。为了验证二者组织定位表达模式的差异，构建了 ATG58：：GUS定位表达载体转入拟南芥，获得了能稳定遗传的纯合体。ATG58：：GUS 组织定位结果显示花苞、花药表达较高，这与水稻 RSSG58 的基因表达模式具有较高的一致性，说明拟南芥 ATG58 与水稻 RSSG58 的功能可能存在相似性。这些结果为进一步解析拟南芥 ATG58 的功能提供了基础，更为深入研究水稻 RSSG58 在雄配子发育过程中的作用及机制提供有价值

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