球孢白僵菌不同施用方式对玉米促生作用的研究

崔雨虹 白云 曹娜 刘亦豪 Ghulam Ali Bugti 王滨

摘 要 采用土壤施用和叶面喷施2种方式将球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株Bb202接种至玉米，研究不同接种方式及处理浓度对玉米生长的影响。结果表明，2种喷施方式对玉米苗均存在促生作用，且这种促生作用与孢子接种浓度密切相关。在叶面喷施处理中，白僵菌仅对玉米地上部分生长指标有促进作用，而对玉米苗的根长无显著影响；其中1.0×104孢子/mL处理组对玉米苗的促生效果最佳，其株高、叶长、叶宽、鲜重指标比蒸馏水对照组分别高出7.47%、15.42%、25.70%和16.85%。在土壤喷施处理中，白僵菌对玉米苗地上与地下部分均有显著促生作用；其中1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组，玉米株高、叶长、根长、生物量指标较蒸馏水对照组分别提高了28.66%和29.59%、30.66%和37.85%、43.08%和33.60%、28.35%和32.55%。从对玉米苗的促生作用来看，用1.0×106孢子/mL的白僵菌悬浮液处理土壤，可以取得最经济、最显著的促生效果。

关键词 球孢白僵菌；玉米；施用方式；促生作用

中图分类号 S476 文献标识码 A

Abstract Experiments were conducted to analyze the effects of B. bassiana on maize as growth promoter in the present paper. Maize leaves and potting soil were inoculated with conidia suspensions of B. bassiana strain Bb202 at different concentrations， with a small spray machine， respectively. Growth of different parts of maize in each treatment was measured and compared. A significant promotion of foliar spray of B. bassiana was observed on the above parts of maize， including the crop height， leaf length， leaf width and biomass， but no significant effect on roots growth. The most significant promotion on maize growth by foliar spray appeared at a low conidial concentration of 1.0×104 conidia/mL with grass height， leaf length， leaf width and biomass higher of 7.47%， 15.42%， 25.70% and 16.85% than that of the controls， respectively. Significant promotion on the growth of all parts of the maize crop including roots appeared in all soil treatments by B. bassiana. Higher concentrations of 1.0×106 conidia/mL and 1.0×108 conidia/mL treatments showed higher promotion effect on maize growth than that of a lower concentration of 1.0×104 conidia/mL. The crop height， leaf length， root length and biomass are respectively higher than that of control by 28.66% and 29.59%， 30.66% and 37.85%， 43.08% and 33.60%， 28.35% and 32.55%. Potting soil treated with B. bassiana suspension of 1.0×106 conidia/mL showed the biggest potential on maize crop as growth promoter.

Key words Beauveria bassiana； maize crop； application method； growth promotion

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.004

自2012年以來，玉米成为中国第一大粮食作物品种[1]。玉米螟（Ostrinia furnacalis）是中国玉米种植中危害最大的害虫，而球孢白僵菌（Beauveria bassiana）（以下简称白僵菌）是田间控制玉米螟的有效生物防治菌类[2-6]。1991年，Bing等[7]发现叶面喷施的白僵菌能在玉米中内生，并能有效控制欧洲玉米螟种群数量。近年来更多的研究证明球孢白僵菌在多种植物上（包括玉米）具有内生性，能够在自然状态或不同人工接种方式下定殖在植物中，对多种害虫、病原菌有很好的抑制作用，可以提高寄主作物的抗病虫能力和促进作物生长，具有生防和促生双重作用[8-9]。目前，有关白僵菌促生作用的研究多采用白僵菌侵染植物种子的方式，而对真正可用于实际生产的喷施、灌根侵染等方式研究较少。同时，关于白僵菌对这些植物的促生机制研究也并不完善，一般认为它可能与其他具有促生作用的植物内生真菌类似，也能产生一些农用活性代谢物质如萘、植物生长调节剂（如吲哚-3-乙酸IAA和脱落酸ABA）和麦角甾类物质等化合物[10-11]。本研究通过采用叶面喷施和土壤施用2种不同处理方式，将不同剂量的白僵菌孢子接种至玉米苗上，研究不同处理对玉米苗生长的影响，从而探究白僵菌不同处理方法及应用剂量对玉米各部位的促生长作用，并为进一步研究其促生机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 球孢白僵菌Bb202，选自安徽农业大学微生物防治省重点实验室RCEF菌种库。

1.1.2 供试玉米品种 粟玉2号，购买于陶氏国光农资公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备与白僵菌孢子培养 SDAY培养基：葡萄糖40 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

将Bb202菌种冻干粉活化后接种到SDAY固体培养基上，于25 ℃中全光照培养；待白僵菌产孢后，刮取孢子制成孢子悬浮液，涂布于SDAY固体培养基上培养8～9 d，待菌株满皿产孢后备用。

1.2.2 孢子悬浮液的制备 用药匙刮取适量培养好的白僵菌孢子粉，分别接入灭菌的0.05%吐温80溶液中，搅拌、振荡10 min；再使用灭菌的内置脱脂棉的注射器过滤；最后使用血球计数板在显微镜下计数，并调整成试验需要的1.0×104孢子/mL、1.0×106孢子/mL、1.0×108孢子/mL共3种浓度。

1.2.3 玉米苗的栽植方法 将玉米种子洗净、擦干，用培养土种植于穴盘中（每穴大小为5 cm×5 cm×5 cm，1穴盘50穴），每穴1粒种子。将穴盘置于通风且光照良好的室内环境中种植培养，室内平均温度26 ℃，每日光照时间8 h。

1.2.4 白僵菌接种方法 本试验主要采用喷施叶片和喷施土壤2种不同的接种方式将白僵菌孢子接种至玉米苗的叶部与根部。

（1）喷施叶片处理组的白僵菌接种方法。在玉米苗萌芽生长至20 cm左右时，分别向玉米叶面均匀地喷施制备好的1.0×104孢子/mL、1.0×106孢子/mL、1.0×108孢子/mL 的白僵菌菌株Bb202的孢子悬浮液，以蒸馏水（CK1）和0.05%吐温80溶液（CK2）为空白对照组。在孢子悬浮液喷施过程中，穴盘表面的培养土均用保鲜膜充分遮挡，以避免叶面喷施的孢子悬浮液进入到土壤中，从而引起试验误差。每个浓度处理组喷施100株玉米种苗，每株玉米种苗喷施10 mL孢子悬浮液。自喷施孢子悬浮液当日起，每7 d对各处理玉米苗进行采样，每次每处理采5株玉米苗，用于测定玉米苗各部位的生长量。

（2）喷施土壤处理组白僵菌接种方法。分别用制备好的1.0×104孢子/mL、1.0×106孢子/mL、1.0×108孢子/mL的白僵菌孢子悬浮液均匀地喷施培养土，喷施剂量为10 mL/（100 cm3）土壤（每穴放置的土壤量）；將穴盘中喷施过白僵菌孢子悬浮液的土壤搅拌均匀后，每穴种植一粒洗净的玉米种子；以蒸馏水（CK3）和0.05%吐温80溶液（CK4）做相同剂量喷施处理，以之作为空白对照；待玉米萌芽并长至10 cm时，开始每周采样，采样及处理方法同喷施叶片处理。

1.2.5 玉米苗各部位的生长量测定 玉米苗的采样每7 d一次，每次分别从不同施用方式与施用浓度处理组中随机抽取5株玉米苗样本。对选取的玉米苗样本，用游标卡尺直接测定株高、叶长和叶宽；测量根部时，则将抽取的玉米苗拔起，用清水将根部泥土洗净，用吸水纸吸干多余水分，然后用游标卡尺测量玉米种苗的根长，并用电子称称量整株玉米苗的鲜重。记录玉米苗各部分生长参数及总生物量。

玉米株高：穴盘土壤平面至玉米最高处的距离。

叶长：叶片与杆交接处至叶片顶端的长度。

叶宽：叶片最宽处的距离。

根长：根着生最高处与根须最顶端的距离。

1.2.6 玉米苗及土壤中白僵菌成菌落数的动态监测

（1）选择性培养基的制备。选择性培养基配方：葡萄糖40 g，再生蛋白胨10 g，琼脂15 g，青霉素600 mg，链霉素硫酸盐2.5 g，放线菌酮500 mg，高锰酸钾100 mg，加水至1 000 mL。

（2）玉米叶片组织成菌落数测定。在喷施叶面处理组中，处理当日即开始采样，每7 d对每个浓度处理采样1次。从玉米苗不同方位的玉米叶上，随机剪取1 g玉米叶片样本；进一步剪碎后，加入10 mL 0.05%吐温80溶液，在涡旋振荡器上振荡10 min，以使叶片上的孢子能均匀悬浮在叶温80溶液中；然后梯度稀释至合适浓度，并用微量移液器精确移取200 μL孢悬液均匀涂布在固体选择性培养基上。每重复3个平皿，将培养皿置于（25±1）℃培养箱中培养，以最终成菌落数为10～100 CFU/皿的稀释浓度为最佳浓度，以此来统计该处理的白僵菌的成菌落数。

（3）土壤成菌落数测定。自白僵菌喷施当日起，每7 d对每个浓度处理采样1次，检测白僵菌在土壤内的数量动态。每次使用直径为1 cm的土壤取样器，对每个浓度处理进行垂直打孔取样，取样深度为5 cm；5点取样后，将土壤样品搅拌混匀，然后再从中抽取1 g土壤样本，用于测定土壤中的白僵菌CFU值。测定方法同上。

1.3 数据分析

所有试验数据均用SPSS软件进行比较分析，以确定白僵菌不同施用方式及施用浓度对玉米苗各部位生长的影响。

2 结果与分析

2.1 白僵菌喷施叶面对玉米苗生长的影响

用白僵菌孢子悬浮液喷施玉米苗叶面后的第7天，各处理组玉米苗的株高、叶长、叶宽、根长和鲜重等各生长参数与对照组之间无明显差异；第14天时，各组玉米苗的株高与叶长指标增长幅度明显下降，而叶宽、根长与生物量（鲜重）等指标的增速仅有小幅度下降，以后各周玉米苗相关生长部位基本保持均匀增长态势（图1）。自第14天起，白僵菌不同浓度处理对玉米苗各生长部位的不同影响逐渐显现出来。第49天时（表1），在1.0×104孢子/mL处理组中，其玉米苗的株高、叶长、叶宽等指标均显著大于其余各处理组，比蒸馏水处理组（CK1）分别高出7.47%、15.42%和25.70%；而1.0×106孢子/mL处理组和1.0×108孢子/mL处理组的株高、叶长、叶宽均与2个对照组（CK1、CK2）接近，无显著差异。玉米苗的生物量指标（鲜重）在各处理中的变化趋势与株高、叶长和叶宽指标一致，这是由于玉米苗的株高、叶长、叶宽等本身就是生物量组成的重要指标。叶面喷施各处理组的玉米根长随着栽培时间的推移基本呈直线增长趋势，各处理组与空白对照间无明显差异，这说明白僵菌的叶面喷施处理对玉米根的生长无显著影响。

通过对玉米苗叶面喷施的白僵菌孢子种群数量的动态监测发现，3个不同浓度处理组的玉米苗叶面的白僵菌孢子数量会随着时间的推移而快速衰减，2组对照组中均没有检测到白僵菌（表2）。在1.0×104孢子/mL处理组中，处理当天叶面成菌落数為7.9×103个/g，第14天下降为2.3×102个/g，第35天已检测不到白僵菌。在1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组中，处理当天叶面的成菌落数分别为8.1×104个/g和3.0×105个/g，远远高于1.0×104孢子/mL处理组；第35天时，2组的成菌落数分别下降至6.0×103个/g 和9.4×103个/g，与1.0×104孢子/mL处理组处理当天叶面成菌落数数值相仿。结合玉米苗的生长量指标来看，在1.0×104孢子/mL白僵菌处理叶面初期，当成菌落数小于1.0×104孢子/g时，白僵菌对玉米苗株高、叶长、叶宽具有良好的促生作用；但随着时间的推移，白僵菌在叶面的残留量逐渐减少直至检测不出，这种促生作用也随之逐渐消失。而1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL的白僵菌在处理初期，因为其浓度过高而对玉米苗的促生作用不明显；但随着时间的推移，其浓度逐渐减低至1.0×104孢子/mL以下时，反而会明显促进玉米苗株高、叶长、叶宽等指标的生长。

2.2 白僵菌喷施土壤对玉米苗生长的影响

用白僵菌喷施土壤的第7天，1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组玉米苗的株高、叶长、根长和生物量（鲜重）等指标均显著大于对照组，而1.0×104孢子/mL处理组与对照组无显著性差异；各处理组玉米苗的叶宽指标与对照组均无显著差异（图2）。此后数天培养过程中，1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组一直与对照组保持这种显著性差异。第49天时（表3），1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组玉米苗株高、叶长、根长和鲜重等指标分别较蒸馏水处理组（CK3）高28.66%和29.59%、30.67%和37.85%、43.08%和33.60%、28.33%和32.55%，其中以根长的增加幅度最大。1.0×104孢子/mL处理组从第14天开始，也逐渐显现出与对照组的差异，表现出对玉米苗株高、叶长、鲜重的促生作用，但增长效果远低于1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组。1.0×106孢子/mL处理组和1.0×108孢子/mL处理组间，在促生作用上并无显著差异。这说明土壤施用白僵菌对玉米苗各部位的促生效果并不是随着白僵菌浓度的增加而不断增加。在各处理浓度的对比中，1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL对玉米苗的促生效果要优于1.0×104孢子/mL处理组。到第49天时，1.0×106孢子/mL处理组和1.0×108孢子/mL处理组仍对根长等指标具有明显促生作用。

对喷施于土壤中的白僵菌孢子种群数量的动态监测发现，土壤的白僵菌孢子数量同样会随着时间的推移而衰减，但衰减速度明显慢于喷施叶面处理组，2组对照组中没有检测到白僵菌（表4）。在1.0×104孢子/mL处理组中，处理当天土壤成菌落数为4.0×103个/g，远低于1.0×106孢子/mL处理组的9.1×104个/g和1.0×108孢子/mL处理组的3.4×105个/g。此后，初始浓度越低的处理，其白僵菌种群数量随时间推移而下降的速度越慢；1.0×108孢子/mL处理组的种群数量下降速度最快。在1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组中，从第28天开始2组土壤成菌落数已相差不大，此后一直维持缓慢递减的趋势。1.0×104孢子/mL处理组的白僵菌成菌落数至第49天时已较难检测出来；而其它2个浓度处理组的成菌落数仍在1×102个/g左右。

3 讨论

白僵菌对植物的内生和促生作用是近年来的研究热点。已有研究证明白僵菌的植物内生性具有普遍性，在棉花、番茄、马铃薯、小麦、咖啡、可可等植物中均可分离得到内生的白僵菌[12-13]。Gurulingappa等[14]发现经白僵菌定殖的小麦植株比未处理组粗壮，小麦地上部分干重提高1.60 倍，地下部分干重提高2.25倍。Griffin[15]发现，经球孢白僵菌分生孢子处理的棉花种子，其棉花苗地上部分干重较对照提高了20.03%，地下部分干重提高了22.65%，棉花苗高增加了17.19%。本研究中，在叶面喷施和土壤施用2种处理方式下，白僵菌对玉米苗存在不同程度的促生长作用。叶面喷施对玉米苗根部生长无明显促进作用，而土壤施用则对根部促生作用明显；同时土壤施用对玉米苗其它部位的促生作用也明显高于叶部喷施。使用白僵菌防治害虫时，多采用喷施叶面和处理土壤的方式，比较这2种不同白僵菌接种方式对玉米苗的促生作用具有明显的应用价值，目前关于不同施用方式对作物促生作用影响的差异性研究尚未见其它报道。

本研究发现，用白僵菌喷施叶面时，对玉米的根长无显著影响，仅作用于玉米的地上部分，这可能意味着叶面喷施的白僵菌可能无法大量有效进入玉米植株内，难以进一步对根系生长产生影响；而喷施土壤应用方式，可能更有利于白僵菌侵入玉米苗而成为内生菌或玉米苗能够通过根部更直接地吸收白僵菌分泌的生长促进因子，从而增加其对玉米苗的全面促生作用。有研究表明，白僵菌可通过灌根的方式在玉米中定殖。不同部位接种白僵菌对玉米苗的促生作用，是由于白僵菌分泌的生长促进因子对玉米苗的直接刺激作用还是由于其内生后产生的促生作用，还需要进一步研究。

在白僵菌对玉米苗促生作用的剂量效应研究中，本研究结果表明，当叶面喷施白僵菌时，以1.0×104孢子/mL的低浓度处理促生效果最好。在不同浓度土壤处理中，1.0×106孢子/mL和1.0×108孢子/mL处理组均对玉米苗存在良好的促生作用，两者差异不显著；其中1.0×106孢子/mL的土壤施用处理组，其株高、叶长、根长和生物量等指标较对照组提高了28.33%～43.08%。本研究结果与魏世誉等[16]用白僵菌灌根时对玉米的促生结果相吻合；生物量的增长幅度与陈正州等[17]研究结果相似（将白僵菌与麦麸混合后穴施，使花生生物量增加22.9%）。研究证实土壤施用白僵菌对玉米苗具有明显的促生作用。

白僵菌作为玉米的主要生防菌，已在玉米螟等害虫的生物防治中取得了良好的防治效果。本研究进一步证明了其对玉米苗的促生作用，而这种促生作用与白僵菌的施用方式与施用剂量有关。根据本研究中白僵菌的促生作用及其种群在玉米苗葉面中的数量动态研究结果，在利用叶面喷施白僵菌防治叶面及钻蛀害虫时，可考虑用较低的应用浓度（1.0×104孢子/mL），通过每21 d施用一次的方式，来达到良好的促生作用及对目标害虫的有效控制；而在土壤施用时，则可考虑1.0×106孢子/mL的应用浓度，如有需要，可在42 d后补施一次，这样会对玉米生长有显著的促生作用，同时也为地下害虫的有效控制提供了保障。

参考文献

[1] 张春雷. 玉米成为我国第一大粮食作物品种[J]. 农产品市场周刊， 2012（47）： 12.

[2] 齐永霞， 陈方新. 球孢白僵菌在玉米根际的定植及对根际微生物的影响[J]. 热带作物学报， 2013， 34（5）： 962-966.

[3] 袁盛勇， 孔 琼， 陈 斌， 等. 球孢白僵菌MZ050724对亚洲玉米螟幼虫毒力研究[J]. 西南农业学报， 2011， 24（2）： 608-611.

[4] 刘玉军， 陈名君， 汤 强， 等. 马尾松毛虫种群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的异质性[J]. 中国生物防治， 2010， 26（2）： 138-142.

[5] 孙继美， 丁 珊， 肖 华， 等. 球孢白僵菌防治松褐天牛的研究[J]. 森林病虫通讯， 1997（3）： 16-47.

[6] 刘智辉. 球孢白僵菌对亚洲玉米螟毒力检测的研究[D]. 武汉： 华中农业大学， 2005.

[7] Bing L A， Lewis L C. Suppression of Ostrinia nubilalis（Hübner）（Lepidoptera： Pyralidae）by endophytic Beauveria bassiana（Balsamo）Vuillemin[J]. Environmental Entomology， 1991， 20（4）： 1 207-1 211.

[8] 路 杨， 徐文静， 隋 丽， 等. 球孢白僵菌植物内生性及其应用研究进展[J]. 东北农业科学， 2016， 41（1）： 73-77.

[9] Greenfield M， Jimenez M I G， Ortiz V， et al. Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae endophytically colonize cassava roots following soil drench inoculation[J]. Biological Control， 2016， 95： 40-48.

[10] 林燕青， 洪 伟. 植物内生真菌研究及应用前景[J]. 福建林业科技， 2012， 39（3）： 186-193.

[11] Muvea A M， Meyhofer R， Maniania N K， et al. Behavioral responses of Thrips tabaci Lindeman to endophyte-inoculated onion plants[J]. Journal of Pest Science， 2015， 3（88）： 555-562.

[12] Reay S D， Brownbridge M， Cummings N J， et al. Isolation and characterization of Beauveria spp. Associated with exotic bark beetles in New Zealand Pinus radiata plantation forests[J]. Biological Control， 2008， 46（3）： 484-494.

[13] Glare T R， Reay S D， Nelson T L， et al. Beauveria caledonica is a naturally occurring pathogen of forest beetles[J]. Mycological Research， 2008， 112（3）： 352-360.

[14] Gurulingappa P， Sword G A， Murdoch G， et al. Colonization of crop plants by fungal entomopathogens and their effects on two insect pests when in planta[J]. Biological Control， 2010， 55（1）： 34-41.

[15] Griffin M R. Beauveria bassiana， a cotton endophyte with biocontrol activity against seedling disease[D]. knoxville： University of Tennessee， 2007.

[16] 魏世誉， 王 娟， 隋 丽， 等.球孢白僵菌在玉米中的定殖研究[J]. 哈尔滨师范大学自然科学学报， 2015， 31（6）： 122-126.

[17] 陈正州， 薛兆银， 周 靖， 等. 球孢白僵菌防治花生田蛴螬药效试验研究[J]. 现在农业科技， 2011（4）： 144-146.