2个育性恢复基因Rf1a和Rf1b在红莲型水稻中的表达量分析

刘海青 杨梦醒 姜慧

摘要 [目的]探究红莲型水稻细胞质雄性不育（CMS）与不同恢复基因之间的作用模式。[方法]利用特异性引物结合荧光定量PCR技术，在红莲型水稻近等恢复基因系L-Rf5、L-Rf6，恢复系9311和不育系粤泰A（YTA）中检测2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的表达量。[结果]Rf1a在L-Rf5、L-Rf6、9311中都能表达，而Rf1b只能在部分材料或部分组织中表达。对同一时期二者的表达量分析发现，L-Rf5和9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b，L-Rf6叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。[结论]该研究结果对研究红莲型恢复系的遗传多样性具有一定的参考价值。

关键词 Rf1a；Rf1b；细胞质雄性不育；荧光定量PCR

中图分类号 S188+.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）25-0139-03

Abstract [Objective]To investigate the mode of action of cytoplasmic male sterility （CMS） and different restorer genes in Honglian type rice. [Method]The expression of Rf1a and Rf1b of BoroII were tested by fluorescence quantitative PCR in the LRf5， LRf6， the restorer line 9311 and the sterile line YuetaiA（YTA）. [Result]Rf1a can be expressed in all of them and Rf1b can only be expressed in partial of them. The expression level of Rf1a was significantly higher than Rf1b in LRf5 and 9311， and the expression of Rf1a in LRf6 was lower than that in Rf1b. [Conclusion]The results of this study have a certain value for the study of genetic diversity of the restorer gene in HLtype.

Key words Rf1a；Rf1b；Cytoplasmic male sterility；Fluorescence quantitative PCR

水稻細胞质雄性不育（CMS）是重要的种质资源。在对包台型水稻雄性不育（BT-CMS）及其恢复机理的研究过程中发现其细胞质雄性不育由线粒体编码的细胞毒素肽引起，2个含PPR蛋白基因中的任何一个均可破坏或降解细胞毒素肽使植株育性恢复，从而在分子水平解释了包台型水稻细胞质雄性不育及育性恢复性的机理[1]。在基因座Rf1处鉴定了2个含PPR蛋白的育性恢复基因Rf1a和Rf1b[2]。Rf1a和Rf1b是来源于同一个基因簇中的2个成员，定位于10号染色体上。研究人员对粳稻的28 000余份cDNA克隆并测序，得到Rf1a[3]。

在对红莲型水稻细胞质雄性不育（HL-CMS）的研究过程中，克隆并鉴定了2个有关的恢复基因Rf5和Rf6。Rf5定位于10号染色体上，其编码的RF5是一种五肽重复区（PPR）蛋白，能够与其配对蛋白（GRP162，识别编码162个氨基酸的富含Gly的蛋白质）互作形成复合物RFC并结合atp6-orfH79，导致这个嵌合基因的转录产物降解，从而恢复育性[4]。Rf6定位于8号染色体上，其编码的RF6与己糖激酶6（OsHXK6）结合，并且促进异常的CMS相关转录物atp6-orfH79降解，从而确保正常的花粉发育和育性恢复[5]。

比对HL-CMS的恢复基因Rf5与BT-CMS的恢复基因Rf1a的序列，发现这2个基因CDS区域完全相同，并且都能编码1个由791个氨基酸组成的蛋白产物，产物包含有16 个三角状五肽重复序列基序和线粒体定位信号肽。新的研究表明2个红莲型恢复基因Rf5和Rf6能够恢复包台型CMS[6]。该试验在红莲型水稻中检测到有包台型恢复基因Rf1a和Rf1b后，利用Chen等[7]开发的InDel-Rf1a标记和Rf1b特异性引物，通过荧光定量PCR[8]的方法在红莲型水稻中对这2个基因的表达量进行分析，结果表明Rf1a在近等基因恢复系L-Rf5、L-Rf6，恢复系9311和不育系粤泰A（YTA）中都能表达，Rf1b只能在部分材料和组织中表达，这将为红莲型恢复基因的遗传模式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

红莲型水稻近等基因恢复系L-Rf5、L-Rf6，恢复系9311和不育系粤泰A（YTA），所有材料均来源于中南民族大学生物技术国家民委重点实验室。

1.2 方法

1.2.1 水稻总RNA提取。

分别取红莲型水稻近等基因恢复系L-Rf5、L-Rf6，恢复系9311和不育系粤泰A（YTA）4种水稻幼苗期叶片和茎，加液氮磨碎成粉末状，用TriZOL法提取总RNA，并完成RNA质量检测。

1.2.2 cDNA的合成及检测。

取2 μg总RNA，加入DNase I去除其中的DNA，利用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒反转得到cDNA。以cDNA为模板用Rf1a和Rf1b的特异性引物，采用半定量PCR将cDNA浓度调成一致。

增片段长度都为180 bp左右。扩增体系为10 μL（H2O 6.7 μL，10×Buffer 1 μL，dNTP 0.8 μL，正向引物0.2 μL，反向引物0.2 μL，rTaq 0.1 μL，cDNA模板 1 μL）；扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，28次循环；72 ℃延伸1 min。

1.2.3 荧光定量PCR。

荧光定量PCR仪器为AB 7500Fast实时定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。反应体系配制须在冰上且避光；设置引物浓度为0.6 μL（10 mmol/L），模板浓度为50 ng/μL；退火温度为58 ℃。

反应体系：SYBR Green 7.5 μL，cDNA模板2 μL，H2O 4.3 μL，引物F 0.6 μL，引物R 0.6 μL。反应程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃变性3 s，58 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，40次循环；60 ℃预热60 s，95 ℃变性15 s，60 ℃复性15 s。在每一循环的退火阶段收集荧光，实时检测反应并且记录荧光信号的变化，得出扩增产物的熔解曲线。以水稻actin作为内参基因，根据荧光定量的数据计算2个基因Rf1a和Rf1b在不同材料不同组织中的表达量。

2 结果与分析

2.1 总RNA和cDNA质量检测

采用Nanodrop2000微量分光光度计检测提取得到的总RNA，浓度均约为2 500 ng/μL，A260/A280比值在1.90～2.00，A260/A230比值在1.90～2.20。经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1），结果显示RNA质量（包括浓度与纯度）良好，可以用于后续试验。RNA反转录得到cDNA，并以cDNA为模板，PCR扩增actin，扩增结果显示cDNA质量良好且无DNA污染（图2）。

2.2 Rf1a和Rf1b在不同组织中表达量的检测

根据荧光定量数据计算不同材料不同组织在同一时期2个基因的相对表達量（图3、4）。在水稻幼苗期，Rf1a在L-Rf5、L-Rf6和9311中都有表达，其中表达量最高的是在L-Rf5的叶片中，所有试验材料里，Rf1a在叶片中的表达量都要高于茎中的表达量；Rf1b的表达只有在L-Rf5的叶片、L-Rf6的叶片和茎中能明显检测到，其中L-Rf6叶片中表达量最高，其余试验材料中没有明显检测到这个基因的表达。

2.3 Rf1a和Rf1b表达量的对比分析

通过对同一时期不同材料和组织中的Rf1a和Rf1b基因表达量的对比（图5），在水稻幼苗时期，L-Rf5和9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b，L-Rf6的叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。在L-Rf5的茎，9311、YTA的叶和茎中，Rf1b都只有很少的表达量。

3 结论与讨论

3.1 结论

该次试验结果表明2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b可以在红莲型水稻不育系和恢复系中表达，其表达量因材料或组织不同而不同。Rf1a在L-Rf5、L-Rf6，恢复系9311和不育系YTA中都能检测到表达而且恢复系中的表达量显著高于不育系。而Rf1b只能在近等基因系恢复系L-Rf5、L-Rf6中显著表达，恢复系9311中表达量较少，不育系YTA中几乎不表达。对同一时期二者的表达量分析，L-Rf5，9311的相同组织中Rf1a表达水平显著高于Rf1b，L-Rf6的叶片中Rf1a的表达量则低于Rf1b。

3.2 讨论

细胞质雄性不育（CMS）由线粒体基因组中的嵌合开放阅读框引起，雄性不育可以通过核基因组中的育性恢复基因（Rf）恢复[9]。CMS/Rf系统已广泛应用于杂交种子生产，有助于阐明植物中线粒体与核基因组之间的相互作用[10]。BT-CMS是由线粒体中orf79导致[2]，花粉育性的恢复是通过10号染色体上育性恢复基因Rf1调控。该调节基因Rf1（包括2个等位基因，Rf1a和Rf1b）已经被克隆并定位在Rf1位点[11-13]。Rf1a和Rf1b均编码含有五肽复合物的蛋白质。具有多个恢复基因位点的配子体CMS/Rf系统开发的F1杂交后代可以产生超过50%的正常花粉粒并表现出良好的结实率[14]，这可能对BT型杂交育种非常有意义[15]。

红莲型的2个主要恢复基因Rf5和Rf6分别定位在10号和8号染色体[4-5，14]。Rf5编码的RF5蛋白与其配对蛋白GRP162互作形成复合物RFC并结合atp6-orfH79，导致这个嵌合基因的转录产物降解，从而恢复育性[4]。Rf6编码的RF6蛋白与己糖激酶6（OsHXK6）结合，并且促进异常的CMS相关转录物atp6-orfH79降解，从而确保正常的花粉发育和育性恢复[5]。在红莲型水稻中，这2个基因表现出相似的恢复能力[14]。

已有的证据显示，在9311内，与BT-CMS相关的2个基因正是Rf5和Rf6[6]。BT-CMS中这2个基因的恢复能力测试结果为热激条件下Rf6的恢复能力比Rf5更稳定[6]。通过比对已公布的Rf1a和Rf5的序列，证实二者为同一基因。水稻育种试验揭示了HL-CMS与BT-CMS恢复和保持关系的相似性[16]。因此推断2个包台型恢复基因Rf1a和Rf1b在HL-CMS中有恢复作用。此次试验结果显示在同一时期相同材料的相同组织中，Rf1a比Rf1b具有明显高的表达量，一个可能的假设是这2个基因的恢复活性存在差异，恢复活性的差异是由于恢复的分子机理不同。这个假设需要更多的试验来证实。

参考文献

[1] 张启发.中国科学家阐明Boro II型水稻细胞质雄性不育和育性恢复的分子机理[J].分子植物育种，2006，4（4）：451-452.

[2] WANG Z H，ZOU Y J，LI X Y，et al.Cytoplasmic male sterility of rice with boro II cytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing[J].The plant cell，2006，18（3）：676-687.

[3] KIKUCHI S，SATOH K，NAGATA T，et al.Collection，mapping，and annotation of over 28，000 cDNA clones from japonica rice[J].Science，2003，301（5631）：376-379.

[4] HU J，WANG K，HUANG W C，et al.The rice pentatricopeptide repeat protein RF5 restores fertility in HongLian cytoplasmic malesterile lines via a complex with the glycinerich protein GRP162[J].The plant cell，2012，24（1）：109-122.

[5] HUANG W C，YU C C，HU J，et al.Pentatricopeptiderepeat family protein RF6 functions with hexokinase 6 to rescue rice cytoplasmic male sterility[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2015，112（48）：14984-14989.

[6] ZHANG H G，CHE J L，GE Y S，et al.Ability of Rf5 and Rf6 to restore fertility of chinsurah boro IItype cytoplasmic male sterile Oryza sativa（ssp.Japonica）Lines[J].Rice，2017，10（1）：2.

[7] CHEN T，ZHANG Y D，ZHU Z，et al.Development of new InDel marker to detect genotypes of Rf1a conferring fertility restoration of BTtype cytoplasmic male sterility in rice[J].Rice science，2014（1）：13-19.

[8] RUBIOPI A J，QUIROZMORENO A，SNCHEZTEYER F.A quantitative PCR approach for determining the ribosomal DNA copy number in the genome of Agave tequila Weber[J].Electronic journal of biotechnology，2016，22：9-15.

[9] HANSON M R，BENTOLILA S.Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male gametophyte development[J].The plant cell，2004，16（6）：154-169.

[10] CHASE C D.Cytoplasmic male sterility：A window to the world of plant mitochondrialnuclear interactions[J].Trends in genetics，2007，23（2）：81-90.

[11] KAZAMA T，TORIYAMA K.A pentatricopeptide repeatcontaining gene that promotes the processing of aberrant atp6 RNA of cytoplasmic malesterile rice[J].FEBS letters，2003，544（1/2/3）：99-102.

[12] AKAGI H，NAKAMURA A，YOKOZEKIMISONO Y，et al.Positional cloning of the rice Rf1 gene，a restorer of BTtype cytoplasmic male sterility that encodes a mitochondriatargeting PPR protein[J].Theoretical and applied genetics，2004，108（8）：1449-1457.

[13] KOMORI T，OHTA S，MURAI N，et al.Mapbased cloning of a fertility restorer gene，Rf1，in rice（Oryza sativa L.）[J].The plant journal，2004，37（3）：315-325.

[14] HUANG W C，HU J，YU C C，et al.Two nonallelic nuclear genes restore fertility in a gametophytic pattern and enhance abiotic stress tolerance in the hybrid rice plant[J].Theoretical and applied genetics，2012，124（5）：799-807.

[15] FUJII S，TORIYAMA K.Suppressed expression of RetrogradeRegulated Male Sterility restores pollen fertility in cytoplasmic male sterile rice plants[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2009，106（23）：9513-9518.

[16] LI S Q，YANG D C，ZHU Y G.Characterization and use of male sterility in hybrid rice breeding[J].Journal of integrative plant biology，2007，49（6）：791-804.