利用不同分子标记分析烟草种质资源多态性

冯吉　程玲　孙光伟　陈振国　蔡长春

摘要 [目的]研究烟草种质资源的遗传多样性及亲缘关系。[方法]利用SSR、EST-SSR和InDel这3种分子标记对53份不同类型的烟草材料进行区别与鉴定。[结果]53份烟草材料可分为2大类群，2个亚类；与EST-SSR和SSR分子标记相比，InDel分子标记以其扩增谱带少、特异性强，易于识别和统计，更适合用于烟草种质资源遗传多样性分析与研究。[结论]该研究能够较好地揭示烟草栽培品种类型间的遗传多样性与亲缘关系，可为烟草种质鉴定和遗传连锁图谱构建提供科学依据。

关键词 烟草；分子标记；遗传多样性

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）29-0139-05

Analysis of Genetic Diversity in Tobacco Germplasms （Nicotiana tabacum L.） Using Different Molecular Markers

FENG Ji， CHENG Ling， SUN Guangwei， CAI Changchun* et al

（Tobacco Research Institute of Hubei Province， Wuhan， Hubei 430030）

Abstract [Objective]To research genetic diversity and relationship in tobacco germplasms.[Method] 53 tobacco materials were distinguished and identified by SSR， ESTSSR and InDel. [Result]53 tobacco materials could be classified into two groups and two subgroups.Compared with the ESTSSR and SSR molecular marker， it was less amplification band， strong specificity， easy identification and statistics for InDel marker. Therefore， InDel molecular marker was more suitable for genetic diversity analysis and research of tobacco germplasm.

[Conclusion]The study is useful in revealing the genetic diversity and relationships among tobacco materials， and providing a scientific basis for the germplasm identification and genetic linkage mapping.

Key words Tobacco；Molecular markers；Genetic diversity

基金項目 中國烟草总公司湖北省公司重点项目（027Y2016-002）。

作者简介 冯吉（1981—），男，湖北武汉人，农艺师，博士，从事分子生物学、生物信息学研究。

*通讯作者，副研究员，博士，从事分子生物学研究。

收稿日期 2017-08-11

烤烟是我国主要的经济作物之一，其种植面积较大，是卷烟工业重要的基础原料 [1]。但是用于烟草品系选育的材料遗传背景狭窄，且育种周期长和工作效率低制约着传统育种工作的进度，造成我国目前烟草育种创新能力较差[2]。因此，拓宽烟草栽培品种遗传背景和优化烟草育种选择程序是今后高产、优质、多抗烟草新品种育种工作的关键。分子生物学的发展及分子标记技术的建立为烟草育种工作提供了可量化、不受环境影响的标准方法，越来越多地被应用到烟草种质鉴定工作中。SSR、TRAP、AFLP等分子标记具有结果可靠、重复性好、多态性丰富、操作简单等特点，已被应用

于烟草种质鉴定中[2-7]。该研究利用已公布的烟草SSR标

记，EST-SSR标记以及自主开发的InDel标记对53份烟草种质资源的亲缘关系进行分析，为烟草种质资源鉴定和遗传育种研究提供新的分子标记，并为拓宽烟草育种遗传基础以及烟草种质资源的研究和利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 不同分子标记

1.1.1 EST-SSR引物对序列。选取多态性较好的16对引物对[8]，引物对序列见表1。

1.1.2 SSR引物对序列。选取多态性较好的20对引物对[9]，引物对序列见表2。

1.1.3 InDel引物对序列。随机选择并开发出45对引物对，引物对序列见表3。

1.2 材料

试验材料以烤烟为主，并适当选取其他材料，共计53份。其中烤烟33份，白肋烟15份，晒烟3份，香料烟2

1.3 方法

1.3.1 CTAB小样法提取DNA。

选取53份烟草种质资源材料的鲜嫩叶片，DNA提取方法参考CTAB 方法[2-7]。

1.3.2 PCR扩增。

PCR反应体系含模板DNA 2 μL，BioTeke的2×power Taq PCR MasterMix（PR1701）5 μL，正向和反向引物（50 ng/μL）各1.5 μL，总体积10 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火温度（50～62 ℃）30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。在TP600梯度PCR仪（TaKaRa，日本）上进行PCR反应。

1.3.3 多态性引物的筛选。

对53份烟草材料初步筛选InDel，EST-SSR和SSR引物对；选择电泳条带清晰且稳定、多态性丰富的引物对进行DNA扩增。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

PCR 扩增产物均用聚丙烯酰胺凝胶（6%）进行电泳分离，电泳所用仪器为Sequi-Gen sequencing cell（BioRad，USA），缓冲液为0.5×TBE。电泳时先用恒定功率100 W 预电泳30 min 左右（玻璃板面温度约为50 ℃），上样后，用恒定功率80 W 电泳1.0～1.5 h，快速显影方法进行电泳后的染色与显影。

1.3.5 数据处理。

统计数据时，InDel，EST-SSR和SSR多态性定义为在扩增产物凝胶电泳带型的某一相同迁移位置上，品种某一条带的有或无，每1个多态性条带记作1个等位基因（假定相同迁移率的条带均来自同一位点上的同一等位基因）。将电泳图谱上清晰出现的条带记为“1”，同一位置無带记为“0”，不清楚难以判断的带记为“.”或“-”，获得“0”和“1”组成的数字矩阵。

1.3.6 遗传多样性分析和聚类树的绘制。

将53个烟草种质资源材料的分子标记数据按要求制成表格，并采用聚类软件NTSYS计算遗传相似性系数，然后根据遗传相似性系数进行类平均法（UPGMA，unweighted pair group method arithmetic averages）聚类，形成数字矩阵，绘出聚类树，形成种质资源的分类。

2 结果与分析

2.1 InDel分子标记的开发

利用B37（红）和B37（白）的重测序数据[9]，与已发表的K326和TN90数据[10-11]进行生物信息分析，预测得到353 349个InDel位点。通过InDel标记建立矩阵，利用矩阵分析样本之间的多态性，参考前人研究筛选参数[12]：插入/缺失碱基数为5～15 bp、插入/缺失变异率（变异率=同类插入/缺失占重测序总样品量的百分比）为30%～70%的InDel位点，最终随机选择并设计出具有代表性InDel引物45对。

2.2 烟草InDel，EST-SSR和SSR的多态性检测

2.2.1 InDel分子标记的多态性检测。

用45对InDel引物对53份烟草种质资源材料进行多态性检测，其中只有20对InDel引物多态性检测能力较强，多态性比例为44.44%。利用这20对InDel引物在53份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的40个多态性位点，每对引物能得到2条多态性条带。部分InDel引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图1。

2.2.2 EST-SSR分子标记的多态性检测。

用16对EST-SSR引物对53份烟草种质资源材料进行多态性检测，其中只有9对EST-SSR引物多态性检测能力较强，多态性比例为56.25%。利用这9对EST-SSR引物在53份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的33个多态性位点，每对引物能得到2～6条多态性条带，平均为4条。部分EST-SSR引物对烟草材料的扩增电泳图谱见图2。

2.2.3 SSR分子标记的多态性检测。

用20对SSR引物对53份烟草种质资源材料进行多态性检测，其中只有15对SSR引物多态性检测能力较强，多态性比例为75.00%。利用这15对SSR引物在53份烟草材料中发现清晰、稳定并可重复的70个多态性位点，每对引物能得到2～9条多态性条带，平均为5条。部分SSR引物对烟草材料的扩增电泳图谱見图3。

2.3 烟草遗传多样性分析和聚类树的绘制

利用NTSYS软件计算种质资源的遗传相似性系数。53份材料的遗传相似性系数为0.37～0.97，平均为0.75。说明53份烟草种质资源的遗传多样性较低，遗传背景变异较少。基于遗传相似性系数，进一步对53份材料进行聚类分析，绘制了UPGMA聚类图（图4）。在遗传相似性系数为0.48时，53份材料被分为2类群。其中第一类群为所有晾晒烟材料（包含白肋

烟、晒烟和香料烟）和部分烤烟材料，第二类群为烤烟材料。

第一类群在遗传相似性系数为0.53 处，又可分为2亚类。第1亚类为大部分的白肋烟材料和部分烤烟材料，第2亚类为全部晒烟、香料烟、部分烤烟以及部分白肋烟材料。

以上结果可以说明：分子标记技术在烟草资源遗传亲缘关系分析中的高效性；晾晒烟种质资源材料与烤烟种质资源材料遗传亲缘关系相对较远，而不同晾晒烟种质资源材料之间（包含白肋烟、晒烟、香料烟）的遗传亲缘关系很近。

3 结论与讨论

随着分子生物学的发展及分子标记技术的建立，越来越多的分子标记被应用到烟草种质鉴定、遗传图谱的构建、抗病性研究等工作中[2-7，9]。该研究中SSR、EST-SSR和InDel这3种分子标记多态性丰富，稳定性强，试验条件较易掌握，都是很好的烟草遗传多样性分析的分子标记方法。但是与EST-SSR和SSR分子标记相比，InDel分子标记以其扩增谱带少、特异性强，易于识别和统计，因而更适合用于烟草种质资源遗传多样性分析与研究。

遗传多样性对物种的生存和发展起着决定性的作用，遗传多样性高，对环境变化的适应能力强，容易扩展其分布范围并孕育成新的品种，因此对遗传多样性的研究，可以探讨物种之间的亲缘关系，同时还有助于充分发现和利用各种基因资源，挖掘重要经济性状的变异并加以科学利用和开发。烟草传入我国已有400 多年时间，虽然经过400多年的人工驯化和培养以及不断地从国外引进已经形成的品种资源，但是近年烟草育种中广泛使用的主体亲本只有少数几种，导致我国育成烟草品种遗传基础日益狭窄[13-14]，该研究结果也从分子水平上印证了我国烟草育种资源的匮乏。该研究还发现相同栽培类型的烟草明显地聚为一类，说明烟草经过各自的生态环境和人为利用目的不同的长期选择而逐渐形成了不同的栽培类型，类型间的差别更多的是因特定生态条件下次生代谢的不同而形成。同时，还发现个别烟草材料偏离原有类型，与其他类型聚为一类，原因一可能是与其血缘关系有关，二可能是与分子标记的偏好有关。

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