Na+、K+、葡萄糖及甘油对高体雅罗鱼精子活力的影响

张涛　李胜忠　牛建功　时春明　焦飞

摘要：【目的】明确水体介质参数与高体雅罗鱼精子活力的关系，解决高体雅罗鱼人工繁殖受精率低及鱼苗鱼种生产效率低的技术难题。【方法】以快速运动时间（FT）、寿命时间（LT）和精子激活率为评价指标，探究Na+、K+、葡萄糖及甘油对高体雅罗鱼精子活力的影响。【结果】Na+浓度为135 mmol/L时高体雅罗鱼精子活力最强，FT为71 s，LT为1020 s，精子激活率为95%；K+浓度为5 mmol/L时高体雅罗鱼精子活力最强，FT为52 s，LT为280 s，精子激活率为80%；葡萄糖浓度为180 mmol/L时高体雅罗鱼精子活力最强，FT为78 s，LT为1200 s，精子激活率为95%；甘油浓度为180 mmol/L时高体雅罗鱼精子活力最强，FT为79 s，LT为1380 s，精子激活率为90%。【结论】适宜浓度的Na+、K+、葡萄糖及甘油具有单独提高高体雅罗鱼精子活力的作用，但高浓度Na+、K+、葡萄糖及甘油对高体雅罗鱼精子的激活率呈明显抑制作用。实际生产中，可选择135 mmol/L Na+、5 mmol/L K+、180 mmol/L葡萄糖或180 mmol/L甘油作为高体雅罗鱼精子的激活液，提高其人工繁殖生产效率。

关键词： 高体雅罗鱼；精子活力；快速运动时间（FT）；寿命时间（LT）；精子激活率

中图分类号： S965.199 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0734-05

Abstract：【Objective】The relationship between water medium parameters and sperm motility of Leuciscus idus was studied to solve the technical problems of low fertility rate and and low production efficiency of fry in L. idus artificial breeding. 【Method】With fast moving time（FT）， life time（LT） and sperm activation rate as evaluation indexes， the effects of Na+， K+， glucose and glycerinon on sperm motility of L. idus were studied. 【Result】When the concentration of Na+ was 135 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 71 s， LT 1020 s， and sperm activation rate 95%. When the concentration of K+ was 5 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 52 s， LT 280 s ， and sperm activation rate 80%. When the concentration of glucose was 180 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 78 s， LT 1200 s， and sperm activation rate 95%. When the concentration of glycerinon was 180 mmol/L， the sperm motility of L. idus was the strongest， with FT being 79 s， LT 1380 s， and sperm activation rate 90%. 【Conclusion】Appropriate concentrations of Na+，K+，glucose and glycerol alone can increase L. idus sperm motility. But high concentrations of Na+， K+， glucose and glycerol inhibit sperm activation rate. In actual cultivation， 135 mmol/L Na+， and 5 mmol/L K+， 180 mmol/L glucose or 180 mmol/L glycerol can be chosen as sperm activation medium for L. idus to improve the efficiency of artificial breeding.

Key words： Leuciscus idus； sperm motility； fast moving time（FT）； life time（LT）； sperm activation rate

0 引言

【研究意義】高体雅罗鱼（Leuciscus idus）又名圆腹雅罗鱼，主要分布于北欧至西伯利亚水系，在我国仅见于新疆额尔齐斯河水系，已被列入新疆二级保护鱼类，是典型的淡水冷水性鱼类，多栖息在水流较缓慢的江河和湖泊中（高攀等，2015）。高体雅罗鱼肉质鲜美，在俄罗斯西伯利亚地区为主要渔捞对象，20世纪90年代前曾为我国新疆阿勒泰地区的重要经济鱼类之一。近年来，受过度捕捞和水利工程建设的影响，高体雅罗鱼的种群数量急剧下降，而且其人工繁殖技术尚未成熟，主要表现为精子受精率及受精卵孵化率较低。因此，筛选出适宜的高体雅罗鱼精子激活液，对其人工增养殖和种群保护具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内有关雅罗鱼人工繁殖的研究已有报道。尹家胜等（2001）研究发现，滩头雅罗鱼成鱼在水温升高时排卵，鱼卵顺利破膜发育到稚鱼，即使天气突变、水温下降，幼鱼也能耐受低温考验。金永焕和郑伟（2003）研究认为，勃氏雅罗鱼亲鱼的优劣对性腺发育至IV期能否产卵起关键作用。黄孝湘等（2004）研究发现，经长途运输后雄性勃氏雅罗鱼性腺退化严重，极易出现精液过熟现象。柳宗元（2006）在勃氏雅罗鱼的人工繁殖过程中采用3针注射法对亲鱼进行催产。孟和平等（2006）认为达里湖东北雅罗鱼的孵化率及苗种成活率不仅取决于总碱度，还与盐度、钙离子（Ca2+）浓度等因素有关。金万昆等（2009）通过高体雅罗鱼人工繁殖试验，发现高体雅罗鱼人工授精的受精率仅比自然受精率高6.9%。杨荣国等（2012）研究证实，采用LRH-A2+DOM两种药物合剂对勃氏雅罗鱼进行催产，能取得较好的效果，其产卵率可达98%，3年累计获得受精卵855万粒。韩国苍等（2015）研究表明，人工辅助天然繁殖技术能使达里湖大量增殖瓦氏雅罗鱼水花鱼苗，且该技术具有成本低、操作简单、无污染等特点，便于推广应用。闫浩等（2016）通过组织学观察东北养殖滩头雅罗鱼性腺发育特征，发现2～3龄个体不论在淡水或弱碱水环境中养殖，其性腺发育时相无明显差异；性成熟的滩头雅罗鱼性腺发育高峰期一年仅出现一次，即为一次性产卵类型。【本研究切入点】大多数鱼类具有体外受精的习性，因此鱼类精子的活力状况与水温、盐度、渗透压等水体环境等因素密切相关（舒琥等，2005；刘鉴毅等，2007），但至今未见有关高体雅罗鱼精子激活体系的研究报道。【拟解决的关键问题】探究Na+、K+、葡萄糖及甘油对高体雅罗鱼精子活力的影响，明确水体介质参数与精子活力的关系，为解决高体雅罗鱼人工繁殖受精率及鱼苗鱼种生产效率低的技术难题提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试高体雅罗鱼取自新疆水产科学研究所水生野生动物保护中心，为3龄体质强健、体表鮮亮完好、轻压腹部有精液流出的雄鱼；体长25～35 cm，体重0.5～0.8 kg。精液采集要求呈乳白色，避免尿液、血液混入，共采集14条雄鱼精液。试验试剂均为国产分析纯，用去离子水配置。参照李飞和万全（2009）的研究结果，钠离子（Na+）浓度梯度设为0、45、85、135和150 mmol/L（以NaCl配制），钾离子（K+）浓度梯度设为0、5、10、20和50 mmol/L（以KCl配制），葡萄糖浓度梯度设为0、90、180、270和360 mmol/L，甘油浓度梯度设为0、90、180、270和360 mmol/L。药品溶液配制后分装至分装瓶中，3 ℃以下密闭遮光保存。试验环境温度18 ℃。

1. 2 试验方法

采用平板载玻片法观察精子的运动情况，以胶头吸管吸1滴不同药品溶液滴在载玻片上，在200倍镜头下定好视野，用尖头针粘取精液至载玻片上，立即观察，秒表计时。以快速运动时间（FT）、寿命时间（LT）和精子激活率3个指标评价精子活力（鲁大椿等，1989；喻达辉等，1998；江世贵等，2000），每个浓度梯度进行2次重复。FT：当精子与溶液相遇，在显微镜下只观察到翻滚的黑点，精子运动速度很快，在整个运动过程中看不清路线。LT：精子开始活动直至90%以上精子停止死亡的时间。精子激活率：在给定视野内被激活的精子数量占全部精子数量的百分比（吴清毅等，2011）。

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2007进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 Na+对高体雅罗鱼精子活力的影响

当Na+浓度在0～135 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力随Na+浓度的升高而增加；Na+浓度为135 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力最强，其FT、LT和激活率分别为71 s、1020 s和95%（表1）。Na+浓度超过135 mmol/L后，高体雅罗鱼精子活力骤然下降。方差分析结果表明，当Na+浓度为135 mmol/L时，高体雅罗鱼精子的FT、LT和激活率均极显著高于其他浓度梯度（P<0.01，下同）。可见，Na+对高体雅罗鱼精子活力存在明显的激活或抑制作用。

2. 2 K+对高体雅罗鱼精子活力的影响

当K+浓度在0～5 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力随K+浓度梯度的升高而增加；K+浓度为5 mmol/L 时，高体雅罗鱼精子活力最强，其FT、LT和激活率分别为52 s、280 s和80%（表2）。当K+浓度超过10 mmol/L后，高体雅罗鱼精子活力随K+浓度的增加而下降。方差分析结果表明，当K+浓度为5 mmol/L时，高体雅罗鱼精子的LT和激活率极显著高于其他浓度梯度，而FT极显著高于除10 mmol/L外的其他浓度梯度，说明K+对高体雅罗鱼精子活力存在明显的激活或抑制作用。

2. 3 葡萄糖对高体雅罗鱼精子活力的影响

当葡萄糖浓度在0～180 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力随葡萄糖浓度的升高而增加；葡萄糖浓度为180 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力最强，其FT、LT和激活率分别为78 s、1200 s和95%（表3）。葡萄糖浓度超过180 mmol/L后，高体雅罗鱼精子活力随葡萄糖浓度的增加而骤然下降。方差分析结果表明，当葡萄糖浓度为180 mmol/L时，高体雅罗鱼精子的FT、LT和激活率均极显著高于其他浓度梯度。可见，葡萄糖对高体雅罗鱼精子活力具有明显的激活或抑制作用。

2. 4 甘油对高体雅罗鱼精子活力的影响

当甘油浓度在0～180 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力随甘油浓度的升高而增加；当甘油浓度为180 mmol/L时，高体雅罗鱼精子活力最强，其FT、LT和激活率分别为79 s、1380 s和90%（表4）。甘油浓度超过180 mmol/L后，高体雅罗鱼精子活力随甘油浓度的增加而骤然下降。方差分析结果表明，当甘油浓度为180 mmol/L时，高体雅罗鱼精子的FT、LT和激活率极显著高于其他浓度梯度。可见，甘油对高体雅罗鱼的精子活力也有明显的激活或抑制作用。

3 讨论

Na+和K+对鱼类精子活力发挥重要的调控作用，但在不同鱼类中这种调控作用存在明显差异。潘德博等（1999）研究证实，Na+浓度为3‰时广东鲂精子的FT最长；苏德学等（2004a）发现在5‰ NaC1溶液条件下的白斑狗鱼精子LT最长；谷巍等（2005）研究发现，高白鲑精子在NaC1浓度为5‰～6‰的条件下FT和LT最长；刘鉴毅等（2007）研究发现，当Na+浓度为2‰时中华鲟精子LT最长。本研究结果表明，Na+浓度为135 mmol/L（盐度为7.9‰）时高体雅罗鱼的精子FT和LT最长，精子激活率最高，说明Na+对不同鱼类精子活力的调控浓度各不相同。谷巍等（2005）证实1.0‰的K+可提高白鲑精子活力；刘鉴毅等（2007）研究发现，K+浓度为0.005‰时中华鲟精子活力最佳，其FT、LT分别为80和174 s；而本研究发现，K+浓度为5 mmol/L（0.37‰）时，高体雅罗鱼精子活力最强，LT最长。可见，K+对不同鱼类精子活力的调控浓度也不相同，且K+激活鱼类精子的适宜浓度远低于Na+的适宜激活浓度。

Na+和K+是通过渗透压来改变鱼类精子活力。鱼类精浆中Na+、K+等离子所产生的高渗环境抑制了鱼类精子活动，当精液排入水体后渗透压的改变促使精子激活，而精子激活后大量消耗自身能量，致使其活力明显降低（苏德学等，2004b；王位莹等，2015）。这种鱼类精子活力的降低可通过选择适宜的Na+和K+浓度来阻止或减缓。因此，在鱼类人工授精中应选择适宜渗透压的Na+、K+激活液，降低鱼类精子能量消耗，延长精子活力，提高鱼类受精率。

国内外已有许多研究证实，鱼类精液中有葡萄糖、果糖等糖类物质的存在，且这些糖类物质在维持鱼类精子活力方面发挥重要作用。Phronen和Hyvarinen（1983）在硬头鳟、白鲑的精液中发现有葡萄糖；苏德学等（2004a，2004b）研究指出，适宜浓度的葡萄糖可延长白斑狗鱼和丁■的精子活力时间和寿命；李胜忠等（2005）研究发现葡萄糖能有效提高凹目白鲑精子活力。本研究结果表明，在180 mmol/L葡萄糖溶液中高体雅罗鱼精子的FT和LT最长，且优于在Na+、K+溶液中的活力表现。说明葡萄糖能有效提高鱼类精子活力，且葡萄糖提高鱼类精子活力的作用强于Na+、K+等。其原因是适宜葡萄糖浓度下鱼类精子能利用外源性葡萄糖补充其激活后在渗透压适应和运动上的能量消耗（李胜忠等，2005；王位莹等，2015）。本研究还发现，甘油浓度为180 mmol/L时高体雅罗鱼精子的FT和LT均达峰值，且与葡萄糖的激活效果相当。这在白斑狗鱼精子上已得到证实（李胜忠等，2013），但有关甘油对鱼类精子活力调控的机理有待进一步研究。

4 结论

适宜浓度的Na+、K+、葡萄糖及甘油具有單独提高高体雅罗鱼精子活力的作用，但高浓度Na+、K+、葡萄糖及甘油对高体雅罗鱼精子的激活率呈明显抑制作用。实际生产中，可选择135 mmol/L Na+、5 mmol/L K+、180 mmol/L葡萄糖或180 mmol/L甘油作为高体雅罗鱼精子的激活液，提高其人工繁殖生产效率。

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（责任编辑 兰宗宝）