广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

李龙　司景磊　夏攀洁　綦文晶　龙开旭　夏利　何剑雄　吴敏　兰干球

摘要：【目的】克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子，确定其活性核心区，为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础。【方法】通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测，根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段，并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值，以确定不同ANK1基因启动子片段的活性。【结果】发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点（TSS）、2个CpG岛和多个转录因子结合位点，并以此作为ANK1基因启动子的分段依据，将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段。成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因，双荧光素酶试剂盒检测结果显示，广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强，与其他片段存在显著差异（P<0.05）。【结论】成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段，且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段。

关键词： 广西巴马小型猪；锚蛋白（ANK）；ANK1基因；启动子；活性分析

中图分类号： S828.89 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0716-05

Abstract：【Objective】In this study， ANK1 gene promoter of Guangxi Bama miniature pig was cloned， and its core activity areas were detected， so as to lay a foundation for researching correlation between ANK1 gene promoter and meat quality traits， and establishing animal disease model. 【Method】Transcription factor binding sites of ANK1 promoter were predicted with online software， ANK1 promoter fragments of different lengths were amplified by specific primers based on transcription factor binding sites. To determine the activity of different fragments， fluorescence values of different promoter regions were tested using dual luciferase kits. 【Result】One transcription starting sites（TSS）， two CpG islands and multiple transcription factor binding sites were found in ANK1 promoter. The results served as basis for segmentation of ANK1 gene promoter and it was devided into eight target fragments of different length， namely P638，P791，P1113，P1163，P1648，P1694，P1796 and P2074. The eight segments was cloned. Through KpnⅠand Hind Ⅲ double enzyme digestion， T4 eukaryotic expression vector linkage and cell transfection， eight dual luciferase kit recombination reporter genes were established. Based on dual luciferase detection， the activity of ANK1 gene promoter was the strongest in P1796 fragment， and the difference with others fragments was significant（P<0.05）. 【Conclusion】In this study， eight fragments of the ANK1 gene promoter from Guangxi Bama miniature pig are successfully cloned and the core region of the ANK1 gene promoter is identified as P1796 fragment by dual luciferase kits.

Key words： Guangxi Bama miniature pig； ankyrins（ANK）； ANK1 gene； promoter； activity analysis

0 引言

【研究意义】锚蛋白（Ankyrins，ANK）作为一种连接蛋白广泛存在于各类组织细胞中，能将细胞内的骨架蛋白和细胞膜上的跨膜蛋白连接起来，组成细胞内的骨架系统，因此又称为骨架蛋白（Rubtsov and Lopi-

na，2000），主要在红细胞膜中表达。ANK家族在参与机体生长发育、蛋白转运及细胞内外信号的传递和维持细胞骨架方面发挥着重要作用（Sedgwick and Smerdon，1999；Bennett and Baines，2001；Michaely et al.，2002；Mohler et al.，2002），因此，加強ANK功能研究有助于阐明与其异常相关疾病的发病机制，为基因诊断和治疗提供理论基础。【前人研究进展】ANK基因家族包括3个独立基因，分别是ANK1、ANK2和ANK3。ANK1基因位于猪的第17号染色体上，在维持细胞结构、肌内脂肪和系水力方面发挥重要作用（Aslan et al.，2012）。ANK1蛋白具有膜结合域（Mem-

brane-binding domain）、血影蛋白结合域（Spectrin-

binding domain）、死亡调控域（Death domain）和碳末端（C-terminal domain），其中，死亡调控域和碳末端属于调控区域（Cunha and Mohler，2006）。目前，有关ANK1的研究主要集中在人类医学上。Delaunay（2007）、Ipsaro等（2009）研究表明，在遗传性红细胞球行增多症（Hereditary spherocytosis，HS）中ANK1基因启动子具有红细胞ANK基因启动子活性的片段，在启动子区域碱基的突变能影响ANK合成，进而导致网状红细胞增多。Imamura等（2012）研究表明，ANK1基因是一个研究不同种族二型糖尿病的新候选易感基因。此外，有研究表明ANK存在于肌膜与肌原纤维之间（Nelson and Lazarides，1984；Gagelin et al.，2002），当肌细胞中ANK发生水解将导致肌纤维、肌原纤维发生皱缩效应，进而致使肌细胞的系水力降低，最终影响肉质风味（Melody et al.，2004；Huff-Lonergan and Lonergan，2005）。目前国内关于ANK1基因启动子的研究较少，主要针对遗传性球形红细胞增多症和肉质性状进行的关联性研究（陈海青等，2013；姜敏等，2016）。【本研究切入点】有关ANK1基因启动子在肉质性状方面的研究较多，但针对该启动子的转录调控研究较少，且至今鲜见广西巴马小型猪ANK1基因启动子活性核心区及其与肉质性状的相关性研究报道。【拟解决的关键问题】以广西巴马小型猪为研究对象，克隆其ANK1基因启动子，并确定ANK1基因启动子的活性核心区，为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型等打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

广西巴马小型猪血液采自广西大学动物科学技术学院广西巴马小型猪饲养基地。Trans 5α感受态细胞和DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，转染的C2C12细胞及pGL3-Basic和pRL-TK质粒均由广西大学动物遗传育种实验室保存提供，高保真PCR扩增试剂盒、DNA连接酶和pMD18-T载体购自TaKaRa公司，细胞培养基购自Gibco公司，胎牛血清（FBS）和转染试剂盒购自Life Technologies公司，胰蛋白酶购自Hyclone公司，双荧光素酶试剂盒购自Promega公司。

1. 2 引物设计与合成

通过Ensembl（http：//ensemble.org/）数据库获得ANK1基因39号内含子，并截取39号外显子83 bp和上游1991 bp作为启动子研究序列。采用CpGProD、SMS CpG、AliBaba 2.0、Promoter Scan、Promoter 2.0 Prediction Server等对启动子转录结合位点进行分析，ANK1基因启动子的2074 bp分割为8个不同长度的目的片段，分别命名为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074。利用Oligo 7.0设计8对特异引物（下划线部分为酶切位点），其中，P-F-Total為共有上游引物（表1）。所有引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 DNA提取

根据DNA提取试剂盒操作说明进行广西巴马小型猪血液基因组DNA提取，利用分光光度计检测DNA浓度和纯度，然后置于-80 ℃冰箱保存备用。

1. 4 ANK1基因启动子片段扩增

采用PCR两步法扩增8个目的片段，第一步以不带酶切位点的引物（S-2074F/S-2074R）扩增获得ANK1基因启动子片段，第二步将不同的启动子片段加上酶切位点，两步的PCR反应体系一致。PCR反应体系20.0 μL；2×Taq DNA酶Mix 10.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s（带酶切位点的退火温度62.5 ℃），72 ℃ 1 min，进行30个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的片段回收后进行相应的连接。其中，pMD18-T连接体系：SolutionⅠ5.0 μL，pMD18-T载体1.0 μL，胶回收产物4.0 μL；T4连接体系：Ligation Buffer 1.0 μL，T4 Ligase 1.0 μL，pGL3-Basic载体质粒胶回收产物3.0 μL，目的片段胶回收产物5.0 μL。获得的P638-2074-pGL3-Basic质粒转化至Trans 5α感受态细胞中，筛选出阳性克隆菌落，对其进行PCR鉴定和双酶切鉴定，然后将阳性克隆分别送至生工生物工程（上海）股份有限公司和深圳华大基因有限公司测序。

1. 5 细胞转染与活性验证

C2C12细胞复苏后，用含10% FBS的DMEM为培养液，置于37 ℃、5% CO2无菌培养箱中培养，当细胞融合率达60%～70%时更换无双抗的培养基培养6 h再进行转染工作。按转染试剂盒说明，每孔2 μg重组质粒+1/20或1/50 μg的pRL-TK质粒进行转染。转染24 h后收集细胞悬液，按双荧光素酶试剂盒E2920操作说明进行活性验证。

1. 6 数据分析

采用DNASTAR的SeqMman、Editseq、MegAlign对克隆序列的正确性进行分析，双荧光素酶报告试验数据使用Origin 8.0和SPSS 22.0进行分析，ANK1基因启动子的转录结合位点利用NNPP、AliBaba 2.0、Promo-

terScan、MethPrimer、Promoter 2.0 Prediction Server、TFSEARCH等在线软件进行分析。

2 结果与分析

2. 1 转录因子结合位点分析结果

由于ANK1基因启动子序列中预测获得的转录因子结合位点很多，需通过AliBaba 2.0、TFSEARCH筛选出比较重要或相关的结合位点，再以NNPP、Promo-

ter 2.0 Prediction Server筛选出转录启示结合位点，采用MethPrimer寻找ANK1基因启动子的CpG岛（图1）。结果从P638片段中挑选出4个转录因子结合位点，分别是GATA-1、CEP-bind、SRF和ATA-1；在P791片段中存在一个CpG岛；在P1113片段中挑选出4个转录因子结合位点，分别是GR、SP1、SP1和SP；在P1163片段中预测出现转录启示结合序列；在P1648片段中挑选出4个转录因子结合位点，分别是myogenin、SP1、GATA-1和SP1；在P1694片段中挑选出GR转录因子结合位点；在P1796片段中存在一个CpG岛；在P2074片段中挑选出5个转录因子结合位点，分别是TATA box、AP-2alpha、MyoD、NFkppa和SP1。

2. 2 广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆结果

以广西巴马小型猪血液DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳检测结果如图2所示。阳性克隆经测序分析，发现8个克隆片段均与Ensemble数据库已发表的对应碱基序列一致。以这些目的片段（P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074）为模板，采用双酶切法与pGL3-Basic载体构建重组质粒，获得8个重组质粒的双酶切鉴定结果见图3。说明成功构建了ANK1基因启动子的双荧光素酶报告基因载体。

2. 3 ANK1基因启动子活性验证结果

双荧光素酶试剂盒检测报告结果经SPSS 22.0分析，结果（图4）发现P1796和P1694的荧光素酶检测报告值与其他6个启动子片段及pGL3-Basic空载体的检测报告值存在显著差异（P<0.05），其中又以P1976片段的活性最强。P638、P791、P1113、P1163、P1648和P2074片段的活性与pGL3-Basic空载体组间不存在显著差异（P>0.05）。P1796和P1694两个片段的活性较强，而其他片段活性较低，可能是ANK1基因启动子片段中存在一些反式作用因子结合位点，或是因为转染到C2C12细胞中而不是猪的肌细胞，导致不同片段的启动子活性降低。

2. 4 P1796特有片段序列分析结果

ANK1基因启动分析结果显示，P1796片段的活性最强。利用在线软件AliBaba 2.0对P1796片段特有碱基序列的转录因子结合位点进行预测，发现AP-4、Sp1、MyoD、Adf-1、NRF-1、E1和c-Ets-1等多个转录因子结合位点存在于这段特有的碱基序列中。AliBaba 2.0对P1796片段序列进行预测分析的结果见图5。

3 讨论

ANK家族包含ANK1、ANK2和ANK3，其中ANK1作为细胞骨架蛋白，在细胞间的信号传递中发挥重要作用，同时参与细胞结构维持、生物体蛋白运输、机体生长等。ANK1基因在红细胞、肌细胞、神经细胞、巨噬细胞中均有表达（Cunha and Mohler，2006；Hoock et al.，1997）。自ANK1被发现至今，其研究范围逐渐扩大，主要体现在ANK1基因启动子与肉质性状的关联性及ANK1在红细胞疾病和二型糖尿病中的作用。已有研究表明，在夏洛来牛、利木赞牛、安格斯牛的ANK1基因启动子区存在5个SNP位点与肉质的嫩度、大理石纹相关（Aslan et al.，2010），且其突变对各年龄段的耗牛肉质具有一定影响（陈海青等，2013）。有关ANK1基因与猪肉质性状的研究也有报道，Byun等（2008）研究表明，在该基因3'UTR区域的一个SNP位点与猪肌肉剪切力、肌内脂肪、肌肉系水力存在关联性。

本研究通过在线软件对ANK1基因启动子区域的结合位点、转录起始位点、CpG岛进行预测分析，发现ANK1基因启动子区域存在1个转录起始位点（TSS）、2个CpG岛和多个转录因子结合位点，并以此作为ANK1基因启动子的分段依據。通过克隆成功获得8个带有重要结合位点或转录起始位点（TSS）及CpG岛的片段，经KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因，以双荧光素酶试剂盒检测，发现ANK1基因启动子活性最强的区域在P1796片段，即确定该片段为ANK1基因启动子的核心区域。利用AliBaba 2.0、Signal Scan和TFSEARCH等对P1796片段碱基序列进行预测分析，发现该序列中存在多个具有激活功能的转录位点，如AP-4、Sp1、MyoD、Adf-1、NRF-1、E1和c-Ets-1。本研究对ANK1基因启动子进行活性验证，其结果为后期开展ANK1基因启动子在肉质、疾病等方面的相关研究打下了理论基础。

4 结论

本研究成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段，且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段。

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（责任编辑 蘭宗宝）