超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维

邓爱妮 范琼 周聪 赵敏

摘要：【目的】优化超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维工艺，为后续野生蔬菜膳食纤维研究工作提供技术参考。【方法】以树仔菜为原料，通过单因素试验考察蛋白酶种类、酶添加量、溶液pH、超声时间和超声温度对总膳食纤维提取率的影响，并在此基础上采用正交试验优化酶解工艺。【结果】蛋白酶种类对树仔菜总膳食纤维提取率影响的排序为木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>碱性蛋白酶>胰蛋白酶；超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶添加量0.60%、溶液pH 5.0、超声时间50 min、超声温度65 ℃，对提取率影响程度排序为木瓜蛋白酶添加量>超声时间>超声温度>溶液pH；在优化条件下，树仔菜总膳食纤维提取率为45.0%，变异系数小于5.00%，测定结果与GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》测定结果（44.8%）基本一致。【结论】超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维具有酶解时间短、操作简便等优点，可用于批量样品总膳食纤维的提取。

关键词： 树仔菜；膳食纤维；酶重量法；超声辅助

中图分类号： TS201.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）06-1062-06

Extraction of total dietary fiber from Sauropus androgynus L. Merr by ultrasonic-assisted enzymatic-gravimetric method

Abstract：【Objective】The extraction process of total dietary fiber from Sauropus androgynus L. Merr by ultrasonic-assisted enzymetic-gravimetric method was optimized， in order to provide a theoretical reference for researching dietary fiber of wild vegetable. 【Method】Using S. androgynus L. Merr as materials， the effects of protease types， enzyme amount， solution pH， ultrasonic time and ultrasonic temperature on extraction rate of total dietary fiber from S. androgynus L. Merr were investigated by single-factor test. Meanwhile， based on the results of single-factor test， the extraction technology was optimized using orthogonal experiment. 【Result】Effects of protease types on extraction efficiency were ranked as follows： papain>neutral protease>alkaline protease>trypsin. The optimal technological parameters for ultrasound-assisted enzyma-

tic-gravimetric extraction of S. androgynus L. Merr total dietary fiber were as follows： papain amount 0.60%， solution pH 5.0， ultrasonic time 50 min and ultrasonic temperature 65 ℃. Extraction efficiency was effected by papain>ultrasonic time>ultrasonic temperature>solution pH. Under the above optimum conditions， the extraction rate of total dietary fiber from S. androgynus L. Merr reached up to 45.0%， which was close to the value（44.8%） of GB 5009.88-2014 Measurement of Dietary Fiber in Food. The coefficient of variation was less than 5.00%. 【Conclusion】The optimized extraction process by ultrasonic-assisted enzymetic-gravimetric method shortens enzymolysis time， and is easy to operate， hence it can be applied in scale extraction of total dietary fiber from samples.

Key words： Sauropus androgynus L. Merr； dietary fiber； enzymetic-gravimetric method； ultrasonic-assisted

0 引言

【研究意義】树仔菜又称五指山野菜、越南菜、天绿香等，为守宫木属灌木，原产于东南亚热带雨林，在我国海南、广东、云南等地有较大面积栽培。树仔菜营养丰富，含有蛋白质5.08%、不溶性膳食纤维2.18%（周聪等，2010）、维生素C 138 mg/100 g（邓爱妮等，2014）等。膳食纤维作为第七大营养素，素有肠道清洁夫之称（Topping and Lockett，2016），是一类不为人体消化和利用的非淀粉多糖，主要有吸水、黏滞、结合有机化合物、交换阴离子等作用，按溶解能力可分为可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维。膳食纤维具有降血压、预防便秘、排毒等保健功能，添加到食品中还可影响产品的风味、颜色、稳定性、保水性和保油性，目前已被广泛应用于食品、保健品和药品中（赵丽等，2014）。因此，研究树仔菜中膳食纤维含量，可进一步提高其深加工产品的附加值，延长树仔菜等野生蔬菜加工的产业链。【前人研究进展】膳食纤维测定常用方法有洗涤法、酶化学法（Zhang and Wang，2013）、仪器法（赵丽等，2014）和酶重量法（张春华等，2015；Ma et al.，2015）。酶重量法是目前国际公认的测定方法，具有操作简单、易实现自动化等优点，但也存在耗时长等缺点。Chen等（2011）研究发现，利用超声辅助酶重量法可加快样品中蛋白质和淀粉的水解过程，缩短膳食纤维提取时间，目前此法已应用于多种植物膳食纤维的提取。如苗敬芝等（2011）分别采用超声水提法和超声结合酶法提取生姜中水溶性膳食纤维，超声时间均为25 min，结果发现超声结合酶法得到的提取率比超声水提法提高38.2%；刘静等（2014）采用超声协同酶法提取香椿老叶可溶性膳食纤维，结果表明，在纤维素酶添加量0.50%、超声温度60.0 ℃、超声时间53.0 min、pH 6.0条件下产品杂质含量低，可溶性膳食纤维提取率为7.11%；赵泰霞和张明玉（2016）采用超声辅助酶解法提取红豆中的膳食纤维，通过单因素和正交试验优化工艺，将酶解时间缩至60 min，得到膳食纤维提取率43.68%。关于树仔菜中膳食纤维含量测定的研究报道极少，仅见于一些野生蔬菜营养成分测定的文献资料中（周聪等，2010）。【本研究切入点】目前尚无利用超声辅助酶重量法提取树仔菜中膳食纤维的研究报道。【拟解决的关键问题】以树仔菜为原料，利用超声辅助酶重量法提取树仔菜中总膳食纤维，优化酶解条件，包括酶种类、酶添加量、溶液pH、超声时间和超声温度等，提高总膳食纤维的提取效率，以期为后续野生蔬菜膳食纤维含量的研究提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

树仔菜采自五指山市南圣树仔菜试验基地，采集可食用嫩茎和叶片部位。耐高温α-淀粉酶（生物试剂）、糖化酶（100000 U/mL）、木瓜蛋白酶（≥3 U/mg）、中性蛋白酶（≥4 U/mg）和胰蛋白酶（≥2500 U/mg）均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碱性蛋白酶（生物试剂）购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、乙酸、氢氧化钠、丙酮等均为国产分析纯，购自广州化学试剂厂。MES-TRIS缓冲液：称取9.76 g 2-（N-吗啉代）乙烷磺酸和6.10 g三羟甲基氨基甲烷，溶于850 mL蒸馏水中，用6 mol/L氢氧化钠溶液于24 ℃调pH至8.2，加蒸馏水稀释至1 L。

主要仪器设备：DGX-9143BC-1型鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；kjeltec8420凯氏定氮仪（瑞典FOSS公司）；SXL-1030程控箱式炉（杭州卓驰仪器有限公司）；HR5026家用多功能粉碎机[飞利浦（中国）投资有限公司]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 树仔菜预处理 将树仔菜样品混匀后，称取适量试样置于（70±1）℃干燥至恒重，反复粉碎至完全过筛（筛板孔径0.3 mm），置于干燥器中待用。

1. 2. 2 总膳食纤维提取 称取1.0 g干燥后的树仔菜样品，加入40 mL MES-TRIS缓冲液，用磁力搅拌直至试样完全分散在缓冲液中，调节溶液pH至5.0，添加0.60%木瓜蛋白酶、50 μL耐高温α-淀粉酶和100 μL糖化酶，固定超声功率100 W，于65 ℃超声处理50 min，后续操作参照GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》对试样残渣进行沉淀、抽滤和洗涤，沉淀物干燥称重，即为总膳食纤维残渣，并通过蛋白质和灰分含量进行校正，得到样品总膳食纤维含量，计算总膳食纤维提取率，结果以干粉计。

总膳食纤维含量（g）=mR-mP-mA

总膳食纤维提取率（%）=总膳食纤维含量/样品质量×100

式中，mR为两份样品残渣质量均值（g），mP为蛋白质质量（g），mA为灰分质量（g）。

1. 2. 3 蛋白酶類筛选 取4份干燥后的树仔菜样品，分别加入木瓜蛋白酶（pH 5.7，55 ℃）、中性蛋白酶（pH 7.0，45 ℃）、碱性蛋白酶（pH 8.0，60 ℃）和胰蛋白酶（pH 8.0，50 ℃），并在各自最适酶解条件下酶解（豆康宁等，2009），后续操作参照1.2.2。

1. 2. 4 单因素试验 在1.2.3的基础上，考察蛋白酶和淀粉酶添加量、溶液pH、超声时间、超声温度等因素对树仔菜总膳食纤维提取率的影响。固定其他条件，每个因素分别设5个水平，其中，木瓜蛋白酶添加量分别为0.25%、0.50%、0.60%、0.70%和0.80%；耐高温α-淀粉酶添加量分别为30、40、50、60和70 μL；溶液pH分别为4.0、4.5、5.0、6.0和7.0；超声时间分别为20、30、40、50和60 min；超声温度分别为45、55、65、75和85 ℃。

1. 2. 5 正交试验设计 在单因素试验基础上，固定其他条件，以木瓜蛋白酶添加量、溶液pH、超声时间和超声温度为考察因素，按L9（34）正交试验法设置正交试验因素水平（表1）。

1. 2. 6 验证性试验 根据正交试验得到的树仔菜总膳食纤维最佳提取工艺条件，进行3次平行试验，计算提取率，与采用GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》方法测得结果进行对比。

1. 3 统计分析

采用Excel 2007对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 蛋白酶种类对树仔菜总膳食纤维提取率的影响

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶对树仔菜总膳食纤维提取率的影响结果见表2，其排序为木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>碱性蛋白酶>胰蛋白酶，以木瓜蛋白酶的总膳食纤维提取率最高，故选用木瓜蛋白酶进行后续试验。

2. 2 单因素试验结果

2. 2. 1 酶添加量对树仔菜总膳食纤维提取率的影响

由图1可知，在固定溶液pH 5.0、超声时间50 min、超声温度65 ℃的条件下，酶解初期，随着木瓜蛋白酶添加量的增加，蛋白酶不断水解总膳食纤维中的蛋白质，蛋白质含量下降，树仔菜总膳食纤维提取率呈降低趋势，木瓜蛋白酶添加量大于0.50%时，总膳食纤维提取率有较大幅度降低；当木瓜蛋白酶添加量由0.60%增加至0.70%时，总膳食纤维提取率略有升高，仅提高了0.25%，变化不明显，说明样品中蛋白质水解趋于完全。

图2为耐高温α-淀粉酶添加量对树仔菜总膳食纤维提取率的影响结果。随着耐高温α-淀粉酶添加量的增加，树仔菜总膳食纤维提取率呈先升高后降低的变化趋势。耐高温α-淀粉酶添加量小于50 μL时，总膳食纤维提取率呈上升趋势；添加量大于50 μL后，总膳食纤维提取率呈下降趋势。因此，耐高温α-淀粉酶的最佳添加量为50 μL。

2. 2. 2 溶液pH对树仔菜总膳食纤维提取率的影响

由图3可知，在固定木瓜蛋白酶添加量0.60%、耐高温α-淀粉酶添加量50 μL、超声时间50 min、超声温度65 ℃的条件下，树仔菜总膳食纤维提取率随溶液pH的增大总体呈逐渐降低趋势。其中，溶液pH在4.5～5.0范围内，树仔菜总膳食纤维提取率基本维持不变，说明此时树仔菜样品中蛋白和淀粉的去除趋于充分；溶液pH大于5.0后，总膳食纤维提取率逐渐降低，可能是pH对木瓜蛋白酶活性和可溶性膳食纤维影响的结果。因此，选择pH 5.0为宜。

2. 2. 3 超声时间对树仔菜总膳食纤维提取率的影响

从图4可看出，在固定木瓜蛋白酶添加量0.60%、耐高温α-淀粉酶添加量50 μL、pH 5.0、超声温度65 ℃的条件下，树仔菜总膳食纤维提取率在超声时间为20～50 min的范围内逐渐升高，超过50 min后，提取率逐渐下降。可能是超声波在物料内部产生强烈振动、极高的加速度和强大的空化效应（郭希娟等，2012），对植物细胞和分子间的作用明显，加速酶解过程，提高酶解效率；延长超声时间，总膳食纤维结构被破坏，导致总膳食纤维提取率下降。故选择超声时间50 min为宜。

2. 2. 4 超声温度对树仔菜总膳食纤维提取率的影响 由图5可知，在固定木瓜蛋白酶添加量0.60%、耐高温α-淀粉酶添加量50 μL、pH 5.0、超声时间50 min的条件下，树仔菜总膳食纤维提取率随超声温度的升高逐渐上升，于65 ℃时达最大值（40.8%）。但超声温度超过65 ℃后，总膳食纤维提取率缓慢下降，可能是温度过高会使溶剂汽化，不利于总膳食纤维的提取。故选择65 ℃为最佳超声温度。

2. 2. 5 各因素与总膳食纤维提取率的方差分析结果

利用Excel 2007对不同提取条件的树仔菜总膳食纤维提取率进行方差分析，結果如表3所示。木瓜蛋白酶添加量和超声时间对树仔菜总膳食纤维提取率有极显著影响（P<0.01），溶液pH和超声温度对提取率有显著影响（P<0.05），耐高温α-淀粉酶添加量对提取率影响不显著（P>0.05）。

2. 3 正交试验结果

由表4可知，超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维的最佳工艺组合为A1B2C2D2，即木瓜蛋白酶添加量0.60%、溶液pH 5.0，超声时间50 min、超声温度65 ℃。4个因素对提取率影响程度的排序：木瓜蛋白酶添加量>超声时间>超声温度>溶液pH。

2. 4 验证性试验结果

根据2.3的最佳提取工艺条件，进行3次平行试验，得到树仔菜总膳食纤维提取率为45.0%（变异系数1.89%，蛋白质含量0.33%），与采用GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》的测定结果44.8%（变异系数1.42%，蛋白质含量12.47%）进行对比，两种方法的测定结果基本一致。

3 讨论

树仔菜蛋白质含量是普通蔬菜的2～4倍，而脂肪、多糖等成分含量较低，因此去除蛋白质是提取膳食纤维的重要工序。在酶工艺中，酶的选择原理是依据其特异性，根据酶作用位点的不同，影响蛋白质的功能性质。食品膳食纤维测定中，常用于水解植物蛋白质的酶有胰蛋白酶（孙静亚和田丽，2010）、碱性蛋白酶（杜欣悦，2014）、中性蛋白酶（韦琴和黄婉星，2014）、木瓜蛋白酶（赵泰霞和张明玉，2016）等，其中木瓜蛋白酶来源于植物，中性蛋白酶和碱性蛋白酶来源于微生物，胰蛋白酶来源于动物。本研究选择这4种蛋白酶用于树仔菜总膳食纤维提取，结果表明，木瓜蛋白酶更有利于树仔菜总膳食纤维的提取，提取率最高，而胰蛋白酶作用下的树仔菜总膳食纤维提取率最低，可能与木瓜蛋白酶水解蛋白质的溶液pH和温度范围较宽有关（宋海琼等，2012）。

酶重量法是利用酶去除淀粉和蛋白质，用乙醇沉淀水溶性膳食纤维，将过滤的膳食纤维残渣称重，并通过蛋白质和灰分含量进行校正（Dhingra et al.，2012）。GB 5009.88-2014《食品中膳食纤维的测定》规定了酶重量法为食品中膳食纤维的测定方法，其酶解过程通常反应95 min。本研究在GB 5009.88-2014方法基础上，利用超声辅助树仔菜总膳食纤维提取过程，超声波产生的强烈振动使树仔菜组织各成分得到更有效地分离，酶解过程耗时控制在60 min内，缩短了酶解时间，在一定程度上提高了提取效率。利用优化工艺提取树仔菜总膳食纤维的提取率45.0%，与GB 5009.88-2014的测定结果（44.8%）基本一致，变异系数小于5.00%。

目前，有关超声辅助技术结合酶重量法提取树仔菜等野生蔬菜膳食纤维的应用报道极少，影响因素的探讨及功能性质的分析仍需不断完善和解决，如超声功率的影响，提取出的膳食纤维组成成分、持水力、膨胀力、持油力、阳离子交换能力等的分析。下一步将对树仔菜总膳食纤维的持水力、膨胀力等功能性质进行研究，以便积累更多的试验数据，为后续野生蔬菜膳食纤维含量研究工作打下基础。

4 结论

本研究通过单因素试验和正交试验优化得到超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维的工艺条件为：木瓜蛋白酶添加量0.60%、溶液pH 5.0、超声时间50 min、超声温度65 ℃，在此条件下的树仔菜总膳食纤维提取率为45.0%。超声辅助酶重量法提取树仔菜总膳食纤维具有酶解时间短、操作简便等优点，具有较高的可行性，可用于批量样品总膳食纤维的提取。

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（责任编辑 罗 丽）