钙对非洲凤仙铅累积特性的影响

张琼　陆銮眉　戴清霞　朱丽霞　卓彩凤

摘 要 通过水培实验，研究钙对非洲凤仙铅耐性和累积特性的影响。结果表明，无钙处理下，随着铅处理浓度增加，非洲凤仙生物量逐渐降低，根系和叶片铅含量逐渐升高，铅处理浓度高于100 mg/L时，非洲凤仙各器官铅含量在10～250 mg/kg之间；与无钙处理相比，外源钙显著促进50、100和300 mg/L铅处理下非洲凤仙的生长；钙对非洲凤仙各器官铅含量影响随铅处理浓度不同而不同，与无钙处理相比，钙显著促进50和100 mg/L铅处理下根系铅累积，显著抑制300和600 mg/L铅处理下根系对铅的吸收累积，钙显著降低100和300 mg/L铅处理非洲凤仙地上部分铅含量；铅处理浓度为100 mg/L时，钙显著降低铅在根系和叶片中活性，也降低根向地上部分转运。由此可知，非洲凤仙对铅具有较高耐性，是Pb富集植物；外源钙能够缓解一定铅胁迫对非洲凤仙的毒害作用，推测缓解效应与钙降低地上部分铅累积含量和降低铅在植株体内活性有关。

关键词 非洲凤仙；铅；钙；铅耐性；铅累积特性

中图分类号 Q948.11 文献标识码 A

Abstract The effect of Ca on Pb tolerance and Pb concentrations in Impatiens walleriana under Pb stress were studied. It showed that Pb inhibited the growth of I. walleriana and the biomass of the seedling decreased with the increase of Pb treatment concentrations. And Pb concentrations in the root and leaf increased with the increase of Pb treatment concentrations. Pb concentrations in organs were 10-250 mg/kg under Pb≥100 mg/L treatment concentrations. The inhibition of Pb was aggravated after Ca pretreatment in 50， 100 and 300 mg/L Pb treatment. The effect of Ca on Pb concentrations in organs varied with Pb treatment concentrations. Ca significantly increased Pb concentrations in roots in 50 and 100 mg/L Pb treatment and inhibited Pb concentrations in roots in 300 and 600 mg/L Pb treatment. Ca significantly decreased Pb concentrations in the overground parts in 100 and 300 mg/L Pb treatment. In 100 mg/L Pb treatment， the availability of Pb in the root and leaf significantly dropped and the Pb transfer was reduced by Ca. So that Pb tolerance in I. walleriana was high and I. walleriana was a Pb accumulator and not a Pb hyperaccumulator； Ca alleviated the toxin of Pb in I. walleriana under 50， 100 and 300 mg/L Pb treatment that was related to the reduce of Pb content in above ground organs and lower availability of Pb in seedling of I. walleriana.

Key words Impatiens walleriana； lead； calcium； lead tolerance； accumulation of lead

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.014

隨着现代工农业发展，重金属对土壤的污染和对人健康的危害日益受到人们的重视[1-3]。研究者通过筛选重金属超富集植物进行生物修复已经取得初步进展：如印度芥菜可同时富集锌、铅、镉和镍[4]；陈同斌等[5]发现砷超富集植物蜈蚣草，并已开展蜈蚣草修复农田土壤工程，效果显著；杨肖娥等[6]发现锌超富集植物东南景天；薛生国等[7]发现锰超富集植物商陆。已报道重金属超富集植物约有500余种，主要集中于芸苔属、庭芥属和遏蓝菜属[2-3]。非洲凤仙（Impatiens walleriana）原产于非洲东部，由于其耐性强、花色艳丽、花期长，故常常被作为园林绿化植物，也是镉超富集植物[8-10]。许多镉超富集植物对其他重金属的耐性和累积也较高，如镉超富集植物东南景天，也是锌超富集植物，而非洲凤仙花对其他重金属耐性和累积特点报道较少。

重金属铅不是植物必需元素，其通过干扰根系矿质元素吸收、破坏细胞膜透性、抑制质子泵活性等机制危害植物正常生理代谢。不同植物对铅耐性不同：对铅较敏感的植物如小叶女贞、木槿和桧柏在低浓度铅胁迫生长被显著抑制[11]；铅耐性较高植物如国槐生长表现为低浓度刺激效应和高浓度抑制效应[12]；有些植物铅耐性更高，当土壤铅含量高达3 000 mg/kg时，植株也能够正常生长，如侧柏、红瑞木、白榆和向日葵等[11-12]。钙是植物必需元素之一，能够通过维持膜稳定性、与重金属竞争离子通道、增强抗氧化系统的信号转导等机制缓解重金属的毒害作用[13-20]：如Cakmak等[16]认为Ca通过维持跨膜电势缓解铝对萝卜的毒害；外源钙降低云杉、玉米和小油菜对镉的吸收累积[17-20]。本研究以非洲凤仙为试材，研究钙对非洲凤仙铅富集潜力的影响，为应用非洲凤仙进行铅污染治理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 非洲凤仙种子为豪情F1，购于厦门爱垦园艺有限公司。

1.1.2 试剂与仪器 所用实验仪器有电子分析天平（AR124CN）、电热鼓风干燥箱（DHG-9030A）、电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）（PerkinElmer， UK）等；所用化学试剂包括PbNO3（分析纯），Ca（NO3）2（分析纯），KMnO4（分析纯），乙醇（优级纯）、NaCl（优级纯），HAc（优级纯），HCl（优级纯），HNO3 （优级纯），H2O2（优级纯）等。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 非洲凤仙花种子消毒后，播种于播种盘（泥炭土）中，种子萌发4周后，移植于营养钵（泥炭土）中。待植株长至10 cm左右，选取长势一致幼苗作为试验材料进行水培试验。幼苗根部浸于0.1%的KMnO4溶液中10 min，用去离子水冲洗干净后置于Hongland营养液（常规配方，钙除外）中水培适应，一周后进行钙铅处理。采用铅5水平钙2水平完全方案，铅处理浓度是根据前期预试验（当铅浓度低于50 mg/L时，铅对非洲凤仙生长影响不明显）进行设置，分别为无（0 mg/L）、抑制生长临界值（50 mg/L）、超过生长临界值2倍（100 mg/L）、超过生长临界值6倍（300 mg/L）、超过生长临界值12倍（600 mg/L），钙浓度分别为0、100 mg/L，共10个处理，其中铅源为PbCl2，钙源为CaNO3。在钙浓度为0 mg/L处理中添加相应浓度的硝酸铵平衡氮素营养。每处理重复6次，营养液3 d换1次，并用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH 调节营养液pH=6.0～6.5，处理1个月后进行以下试验。

1.2.2 生物量测定 将植物材料用蒸馏水冲洗干净，105 ℃下杀青15 min，70 ℃下烘干72 h，测定干重。

1.2.3 植物体内铅化学形态分析 采用化学试剂逐步提取法分析铅在非洲凤仙体内的化学形态[21]。称取植物鲜样0.500 0 g，加入提取液，研磨匀浆，恒温震荡后离心，取上清液。依次采用的5种提取剂为：80%乙醇，去离子水，1 mol/L NaCl溶液，2% HAc，0.6 mol/L HCl。一般认为80%乙醇主要提取醇溶性蛋白质、氨基酸盐等物质，去离子水主要提取可溶于水的有机酸盐，氯化钠提取果胶盐和难溶性碳酸盐，2% HAc提取难溶性磷酸盐，0.6 mol/L HCl提取草酸盐，残渣中则为难溶性硅酸盐[21]。

1.2.4 铅含量测定 将化学形态分析中水样置于电热板消解，采用电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）（PerkinElmer， UK）测定其铅含量。烘干植物样（根、茎和叶）研磨后加混合消解液（HNO3 ∶ H2O2=1 ∶ 1，V/V），置于消解罐消解，采用电感耦合等离子质谱仪（ICP-MS）（PerkinElmer， UK）测定其铅含量。

1.2.5 富集系数和转运系数 生物富集系数为植株根系重金属含量与培养介质重金属含量比值，生物转运系数为植株地上部分重金属含量（茎和叶）与根系重金属含量比值。

1.3 统计分析

本研究中数值均为3次重复平均值。应用SPSS軟件进行单因素方差分析，并进行多重比较（SSR法），显著性水平为p<0.05。所有数据作图均采用Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 非洲凤仙生物量

由图1可以看出，无钙处理下随着铅处理浓度增加，非洲凤仙生物量逐渐降低，与Pb 0 mg/L浓度处理相比，Pb 50、100、300和600 mg/L处理组植株生物量均显著下降，分别下降13.8%、17.5%、18.2%和27.0%；有钙处理组中，与Pb 0 mg/L处理相比，50 mg/L铅处理没有显著影响植株生物量，100～600 mg/L铅处理显著抑制植株生长。

在Pb处理浓度为50、100和300 mg/L时，与无钙处理相比，外源钙显著增加非洲凤仙生物量，分别增加了13.0%、11.6%和5.1%；钙没有显著影响无铅处理和600 mg/L铅处理下植株的生物量。

2.2 非洲凤仙根、茎、叶中Pb含量

2.2.1 非洲凤仙根Pb含量 由图2可知，Pb 0 mg/L处理下有钙和无钙处理中根系没有检测到铅；在无钙处理下根系铅含量随铅处理浓度增加而显著增加；有钙处理组中，Pb 100和600 mg/L处理组根系铅含量间差异不显著，但显著高于Pb 50和300 mg/L处理组。

在Pb浓度为50和100 mg/L时，外源钙显著增加根系铅含量，在Pb浓度为300和600 mg/L时，外源钙显著降低根系铅累积含量，尤其在Pb 600 mg/L处理中，与无钙处理相比，加钙处理组根系铅含量降低56.6%。

2.2.2 非洲凤仙茎Pb含量 由图3可以看出，Pb处理浓度为0 mg/L时，茎没有检测到铅；无钙处理中，50～300 mg/L铅处理范围内随铅处理浓度增加，茎铅含量显著增加，而600与300 mg/L铅处理之间差异不显著；有钙处理中茎铅含量随铅处理浓度增加而显著增加，至600 mg/L铅处理时达到最高。

Pb处理浓度为50 mg/L时，外源钙没有显著影响茎铅含量；Pb处理浓度为100和300 mg/L时，外源钙显著降低茎铅含量，与无钙处理相比，分别降低17.1%和27.9%；在Pb处理浓度为600 mg/L时，外源钙显著增加茎中铅含量，与无钙处理相比，增加46.2%。

2.2.3 非洲凤仙叶Pb含量 由图4可以看出，Pb处理浓度为0和50 mg/L时，叶片中没有检测到铅；无钙处理组中，300和600 mg/L铅处理组叶片铅含量差异不显著，但均显著高于100 mg/L铅处理组；有钙处理组中，随着铅处理浓度增加，叶片铅含量显著增加。

Pb处理浓度为100和300 mg/L时，外源钙显著降低叶片Pb含量，与无钙处理相比，分别降低44.1%和6.0%；Pb浓度为600 mg/L时，外源钙显著增加叶片铅含量，与无钙处理相比，增加30.5%。

2.3 Ca对非洲凤仙Pb转移系数的影响

由表1可知，铅处理为100 mg/L时根系富集系数最高，钙明显提高根对铅的富集能力，而在铅处理浓度较高时（300和600 mg/L），钙降低根系对铅的富集能力；Pb处理浓度为300和600 mg/L时，外源钙明显提高根系向叶片的转移能力。

2.4 Pb在非洲凤仙中的化学形态

100 mg/L Pb处理条件下，由图5可知，非洲凤仙叶片和根残渣态中Pb所占比例最低，而乙醇提取态所占比例最高。Pb在叶片中各提取态比例由大到小依次为：乙醇提取态>醋酸提取态>氯化钠提取态>盐酸提取态>水提取态>残渣态，Pb在根中各提取态比例依次为：乙醇提取态>盐酸提取态>醋酸提取态>氯化钠提取态>水提取态>残渣态。钙显著降低根系铅乙醇提取态比例，而增加醋酸提取态比例；钙显著降低叶中铅氯化钠提取态比例，而显著增加残渣态比例。

3 讨论

铅是植物非必需元素，具有较强毒性，当铅在植物体内达到一定浓度时会抑制植物生长，导致叶片失绿、植株矮小、根系短小或腐烂等[22-24]。本研究无钙处理组中非洲凤仙根和叶铅累积含量虽然随铅处理浓度增加而增加，但在50、100和300 mg/L铅处理下植株能保持正常生长，生物量分别为无铅处理组的86.2%、82.5%和81.8%。耐性临界值是植物能够保持正常生长而耐受胁迫程度的临界值，生物量减少10%为耐受胁迫下限的标准，生物量减少20%为其上限标准[25]。一般植物体内含量不超过10 μg/g，非洲凤仙在铅浓度为300 mg/L，植株地上部分铅含量高于20 μg/g，而根系中铅含量高于100 μg/g，仍未达到耐性临界值的上限，表明非洲凤仙具有较强的耐铅性。不同植物铅耐性不同，与非洲凤仙相比，铅超富集植物羽叶鬼针草和印度芥菜生长铅耐性更强，100 mg/L铅处理仍促进两者生长[22]。

钙是植物必需营养元素之一，许多研究表明钙能够增强植物的抗逆性，缓解重金属对植物的毒害作用[26-29]。比如外源钙能够缓解铅对玉米根尖有丝分裂的毒害；低浓度钙对铅胁迫下红花种子萌发具有促进作用[26-27]。一些研究认为钙对铅毒害的缓解效应机制主要在于钙与铅离子竞争吸收运输位点而降低植株对铅的吸收[28]，如钙显著降低草莓植株和遏蓝菜地上部Pb含量[28，30]。本文中钙缓解50、100和300 mg/L铅处理下铅对幼苗生长的抑制，但钙对铅在植物体内的累积影响在不同铅胁迫处理浓度下不同。在300和600 mg/L铅处理下，外源钙显著降低根系对铅的累积吸收，推测是由于钙离子与更多铅离子竞争钙离子通道，抑制植物对铅的吸收；但在低浓度铅处理下，外源钙显著促进根系对铅的吸收，推测由于根系对铅的吸收途径有多种，其中包括钙离子通道、胞吞作用、钙调蛋白和其他阳离子转运蛋白等[31]，外源钙刺激铅吸收通道活性，进而促进铅的吸收。虽然钙促进100 mg/L铅处理下凤仙根系对铅的吸收累积，但钙抑制該铅处理下铅在茎和叶片中的累积，推测在该铅处理浓度下钙抑制地上部分铅累积从而缓解铅对植株生长的抑制。

由于100 mg/L铅处理下，钙显著增加根中铅含量，但显著降低叶片铅含量，推测100 mg/L铅处理浓度下钙增加铅在根系的束缚形态，降低铅的可移动形态，进而降低了铅向地上部分的转运，所以选用100 mg/L铅处理分析植株体内铅化学形态。本研究表明铅在非洲凤仙中主要与醇溶性蛋白质和氨基酸结合，其次为难溶性盐，可溶性有机酸盐形式比例较小，难溶性硅酸盐比例最小，而在大花萱草、水稻和小麦中，Pb主要结合在草酸盐和难溶性磷酸盐[32-33]，侧柏和国槐中Pb主要以胶盐、难溶性碳酸盐和难溶性磷酸盐形式存在[12]，而非洲凤仙根和叶中铅形态分布特征与这些植物不同，可能在于不同植物重金属耐性和解毒机制不同。有些研究表明改良剂通过影响铅在植物体内活性而影响植物铅耐性，如外源锌降低长柔毛委陵菜植株体内活性较强的铅形态，增加活性弱的铅结合形态[34]，施硅使烟草各部位中铅乙醇提取态、去离子水提取态和氯化钠提取态向盐酸提取态和残渣态转化，从而降低烟草体内铅的毒性与迁移性[35]。本文中铅处理浓度为100 mg/L时，钙显著降低根系中乙醇提取态铅比例，而显著增加醋酸提取态比例，表明钙降低铅在根系中活性，而且根叶转运系数和根茎转运系数明显低于无钙处理进一步验证钙显著降低铅活性进而降低铅由根系向地上部分的转运。对于叶片，钙显著降低活性较强的铅形态比例，而显著增加活性弱的铅形态比例，表明钙降低了铅在叶片中活性，缓解铅对植株生长的影响。

一般认为植物铅含量小于10 mg/kg，转运系数小于0.1，铅含量在10～1 000 mg/kg之间植物称为铅富集植物，铅含量大于1 000 mg/kg，且转运系数大于1被称为铅超富集植物[36]。本研究通过水培非洲凤仙，在系列Pb浓度处理下，非洲凤仙的茎和叶的转运系数大于一般植物，但小于超富集植物。无钙处理下，铅处理浓度高于100 mg/L时，非洲凤仙各器官铅含量在10～250 mg/kg之间，由此可知非洲凤仙是Pb富集植物，而不是Pb超富集植物。

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