金柑果皮精油超声波辅助提取工艺优化及其抑菌、抗氧化活性

黄灿灿　邓昌俊　陈培林　王绍引　曾红亮　张怡

摘 要 采用响应面法对金柑果皮精油超声波辅助提取提取工艺条件进行优化，并对金柑果皮精油的抑菌和抗氧化活性进行评价。结果表明，金柑果皮精油超声波辅助提取的最佳工艺条件为：液料比27 ∶ 1 mL/g、超声时间1.25 h、超声波功率300 W。在此条件下，金柑果皮精油得率为2.24%，与理论预测值基本一致。金柑果皮精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、黑曲霉、酵母菌均有一定抑制作用，最小抑菌浓度分别为1.0%、0.5%、0.5%、0.5%、0.1%。抗氧化活性结果表明，金柑果皮精油对食用油脂的货架期有一定的延缓作用，具有一定的清除羟自由基、DPPH自由基的能力和总抗氧化能力。

关键词 金柑；果皮精油；超声波；抑菌活性；抗氧化活性

中图分类号 TQ644.14；S666.2 文献标识码 A

Abstract The ultrasonic extraction technology of kumquat peel essential oil was optimized by a response surface methodology， and its antibacterial， antioxidant activity was further investigated. The optimal extraction conditions were as follows： liquid-material ratio of 27 ∶ 1 mL/g， ultrasonic time of 1.25 h， ultrasonic power of 300 W. Under the conditions， the yield of kumquat peel oil was 2.24%， which was consistent with the predicted value. Kumquat peel essential oil displayed effective antibacterial activity for Staphylococcus aureus， Escherichia coli， Salmonella， Aspergillus niger and Saccharomycetes， and the minimal inhibitory concentrations was 1.0%， 0.5%， 0.5%， 0.5%， 0.1%， respectively. Based on the investigation of the antioxidant activity for kumquat peel essential oil， it indicated the kumquat peel essential oil could delay the shelf life of edible oil and had a certain ability to remove hydroxyl radicals， DPPH free radicals and total antioxidant capacity.

Key words Kumquat peel； essential oil； ultrasonic extraction； antibacterial activity； antioxidant activity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.026

金柑[Fortunella margarita（Lour.）Swingle]，又名金桔，屬于芸香科柑橘属，原产于中国，是中国特产果树之一，有1 600多年栽培历史[1]。金柑营养丰富，富含多糖、柠檬苦素、多酚和精油等活性物质。金柑多糖具有降血脂[1]、抑菌[2]、抗氧化[2]等功效。金柑果皮近表皮组织中会产生大量油胞，油胞内含有大量的金黄色色素和芳香油等，其油质温和，质量为柑橘类精油之最[3]。柑橘果皮加工的重要途径之一便是精油的提取，柑橘皮渣或质次的柑橘整果经过适当的物理、化学处理，可得到具有很高使用价值的柑橘精油[4-5]。

柑橘类精油是天然植物精油中重要的一类，其气味清新令人愉悦，广泛地使用在食品、医药、日化产品等行业[5]。柑橘精油中含有多种低分子的抗菌物质和抗氧化成分，作为果蔬类天然保鲜剂，能有效地抑菌防腐[6]。傅维擎等[7]报道金柑果皮精油功能团鉴定结果表明，金柑果皮精油含有醇类、醛酮类、不饱和脂肪酸，不含酚类、羧酸衍生物。章斌等[8]利用水蒸气蒸馏法提取柠檬果皮精油，结果表明，其有较好的抗氧化性，并对6种微生物有抑制作用。吴均等[9]测定甜橙精油有较强的抗氧化性和抑菌作用。王绍引等[10]报道金柑果皮精油对桔小实蝇雌虫均有显著的引诱活性。精油的提取大多以水蒸气提取法为主，如姜敏[4]利用水蒸气提取柑橘果皮精油，其萃取时间长、效率低。超声波强化溶剂萃取法萃取精油，即在传统有机溶剂萃取精油的基础上，加入超声波处理，利用超声波空化、振动、粉碎等综合效应破坏细胞壁，加速化学成分溶出，节约了能源，缩短了提取时间[6]。但有关超声波强化溶剂萃取法萃取金柑果皮精油的研究尚未见报道[9-13]。

因此，笔者在考察料液比、超声时间和超声功率等因素对金柑果皮精油得率影响的基础上，采用响应面法对金柑果皮精油超声波辅助提取工艺条件进行优化，并对所得金柑果皮精油的抑菌和抗氧化活性进行评价。该研究为金柑果皮精油的综合开发利用提供了一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 金柑皮，由尤溪县农业局提供；菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、沙门氏菌（Salmonella），均由福建农林大学甘蔗研究所实验室提供。抑制羟自由基试剂盒、抗超氧阴离子试剂盒和总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒，均购自南京建成生物研究所。

1.1.2 主要仪器 KQ2200DE型三频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；RE-5299型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；H-1850R台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Phs-3C型精密pH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 果皮精油提取工艺优化 （1）金柑果皮精油提取工艺。金柑果皮→粉碎→过筛→称重→加入萃取剂→超声波辅助浸提→料液分离（抽滤）→混合滤液→旋转蒸发→加乙醇溶解→放入-15 ℃冰箱冷冻24 h→离心去除脂状物质→过滤→滤液进行真空浓缩。金柑果皮精油得率计算公式如下：金柑果皮精油得率=果皮精油质量/果皮粉末质量×100%。

（2）单因素试验。取10 g金柑果皮，以金柑果皮精油得率为指标，研究液料比（mL/g），超声时间（h），超声波功率（W）对金柑果皮精油得率的影响。分别选取液料比10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、25 ∶ 1、30 ∶ 1、35 ∶ 1 mL/g，超声时间0.5、1、1.5、2、2.5 h，超声波功率60、120、180、240、300、360 W进行单因素试验。

（3）响应面优化试验。在单因素实验基础上，以精油提取率（Y）为目标函数，应用Box-Behnken Design的中心组合实验设计，各因子编码水平见表1。表1中A=（X1-25）/5；B=（X2-1）/0.5；C=（X3-270）/30。

（4）验证试验。根据响应面预测的最佳提取工艺条件，确定金柑果皮精油得率，以验证响应面预测的准确性。

1.2.2 果皮精油抑菌试验 （1）菌种活化和菌悬液的制备。参照曾红亮等[14]研究方法。

（2）果皮精油抑菌圈测定。参照曾红亮等[14]研究方法。

（3）果皮精油最小抑菌浓度测定。最小抑菌质量浓度（MIC）采用逐步稀释法进行测定。具体操作步骤为：将制备好的金柑果皮精油按比例加入30 ℃左右的液体培养基中，最终培养基含有精油的浓度百分比分别为2.0%、1.5%、1%、0.5%、0.1%、0。取10 mL混合物注入试管，以不添加金柑果皮精油的培养基作空白对照。将适宜浓度菌种接種在试管的液体培养基中，细菌37 ℃、18 h，真菌28 ℃、36 h培养，进行观察。可抑制细菌出现明显增长的最低精油浓度即为MIC。

1.2.3 果皮精油抗氧化试验 （1）果皮精油在油脂体系中抗氧化活性。分别在具塞磨口瓶中，加入预处理好的熬制猪油和橄榄油各100 g和不同量的金柑果皮精油，搅拌均匀后，置于70 ℃的烘箱中保存，每隔24 h搅拌l次并交换它们在烘箱里的位置，每隔2天取样测定其过氧化值（POV）。以POV值的大小衡量精油的抗氧化活性。每个样品重复3次，取平均值。POV的测定按照GB/T 5538-2005方法进行。

（2）果皮精油总抗氧化能力（T-AOC）。参照吴均等[9]实验方法，以Vc作为阳性对照。总抗氧化能力=[（OD样品-OD对照）/0.01]÷30×N×n。

（3）果皮精油羟自由基测定。参照章斌等[8]实验方法，以Vc作为阳性对照。抑制羟自由基能力=[（OD对照-OD测定）/（OD标准-OD空白）]×样品标准浓度÷（待测样品蛋白浓度×取样量）。

（4）金柑果皮精油DPPH测定。参照章斌等[8]实验方法，以Vc作为阳性对照。DPPH自由基清除率=[1-（A样品-A空白）]/A对照×100%

1.3 数据分析

采用Design Expert 8.06软件对精油提取数据进行处理，并对模型进行显著性分析；采用DPS 9.05对抑菌效果数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素水平的确定

2.1.1 液料比对金柑果皮精油得率的影响 由图1可知，在液料比为10 ∶ 1～25 ∶ 1 mL/g时，金柑果皮精油得率随着液料比的增大而显著提高，这可能是由于金柑果皮和萃取剂之间充分接触使精油加速从果皮细胞中溶出[11]。继续增大液料比至30 ∶ 1，得率趋于平稳未有明显变化；当液料比为25 ∶ 1时，得率最大。因此，液料比选取为25 ∶ 1 mL/g较为合适。

2.1.2 超声时间对金柑果皮精油得率的影响 由图2可知，当得时间小于1 h时，随着时间的增加，金柑果皮精油的得率在不断增大，超声时间大于1 h时，得率已基本趋于稳定。这可能是因为随着超声时间的增加，超声波充分作用于金柑果皮细胞壁使其破裂从而使精油释放到萃取剂中。超声时间越长，金柑果皮细胞壁在超声波空化作用下被破坏程度越大[2]。当超声波处理到一定时间后，金柑果皮细胞壁破裂程度不再增加，所以得率随着时间的增加趋于平稳。因此，超声时间选择为1 h为宜。

2.1.3 超声功率对金柑果皮精油得率的影响 由图3可知，在试验选取的超声波功率区间内，随着超声功率的增大，得率在显著增大。随着超声波功率的增加，超声波的空化作用和机械剪切作用增强，分子扩散速度增加，有利于精油的得率[11]。因此，超声波功率选择为300 W。

2.2 响应面分析

2.2.1 分析因素的选取及分析方案 根据单因素试验结果，以液料比（mL/g）、超声时间（h）、超声功率（W）为决策变量，以精油得率（%）为目标函数，应用Design Expert 8.06软件响应面回归试验设计，试验设计与结果见表2。

2.2.2 模型的建立与显著性分析 回归模型的方差分析、各项的方差分析和参数估计及显著性分析的结果分别见表3。利用Design Expert 8.06软件对上述结果进行分析，得金柑果皮精油得率对液料比（A）、超声波得时间（B）、超声波得功率（C）的二次多项回归方程为：Y=1.98+0.25×A+0.12×B+0.10×C+0.059×A×B-0.10×A×C+0.059×B×C-0.22×A2-0.054×B2-0.029×C2。

从方差分析结果可知，实验所选用模型p值为<0.000 1，表明该回归模型达极显著水平；在一次项中，A、B和C对精油得率的影响达到极显著；在交互项中，AC对精油的得率影响达到极显著水平，AB和BC对精油的得率影响达到显著水平；在二次项中，A2对精油得率达到极显著水平，B2对精油得率达到显著水平；失拟项不显著，并且该模型的相关系数R2=0.975 8，变异系数CV=3.98%，说明响应值的变化97.58%来源于所选变量，该值接近于100%，这表明模型可以较好地解释实际试验中金柑果皮精油得率的变化。因此，该回归模型能较好地描述各因素（液料比、超声波功率、超声时间）与金柑果皮精油得率之间的实际关系，可用于最佳超声波得金柑果皮精油工艺参数的确定。

2.2.3 响应面图和等高线图分析 综合图4～6可知，液料比和超声时间交互作用、液料比和超声波功率交互作用、超声时间和超声波功率交互作用对金柑果皮精油得率影响最为显著，表现为曲面较陡，这与方差分析结果一致。在液料比和超声波时间、液料比和超声波功率交互作用中，当其他因素条件固定时，精油的得率起初随着液料比的增大而增大，当液料比超过一定值时，精油得率随着液料比增大而下降。这可能主要是一定范围内液料比的增加会相应地增大溶剂与原料的接触面积，同时增大固液压差，致使扩散速度得到提高；但是当液料比过大时，精油在溶剂中的溶解量增加，降低了精油的得率[15]。在超声时间和超声波功率相互作用中，其他因素条件固定时，精油得率随着超时间的增加而增大，当超声时间超过一定值时，精油得率上升趋势变缓；这可能是由于在一定时间内超声波处理提高了精油分子运动频率和速度，且由于超声波的机械剪切作用和空化效应破坏了精准果皮细胞壁加速了精油分子从细胞中溶出，但超声时间超过一定值时，超声波可能会破坏精油分子结构，降低得率[16]。

2.2.4 金柑果皮精油提取工艺的确定 由回归方程可知，超声波强化溶剂萃取金柑果皮精油的最优条件为：液料比27.4 ∶ 1 mL/g，超声时间1.25 h，提取功率300 W。该条件下超声波强化溶剂萃取金柑果皮精油的理论得率为2.22%。结合回归模型，并根据实际操作条件调整选用液料比27 ∶ 1 mL/g、超声时间1.25 h、提取功率300 W，重复试验3次，得金柑果皮精油的平均得率为（2.24±0.02）%，与理论预测值基本一致，说明回归模型可靠。

2.3 金柑果皮精油抑菌作用

植物精油中含有醇类、醛类、酸类、酚类、丙酮类、萜烯类物质，这些物质可以影响细胞膜渗透性，导致细胞膜的通透性发生改变，细胞内容物外泄，甚至维持细胞生命的大分子或遗传物质外泄，最终导致细胞死亡[17]。精油抑菌圈实验结果的判定标准为：抑菌圈直径>15 mm为最敏感，10～15 mm 为中度感，7～9 mm时为低度敏感，无抑菌圈者为不敏感[8]。由表4和图7可知，金柑果皮精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母的抑菌抑菌圈直径均>15 mm，均属最敏感：对黑曲霉、沙门氏菌的抑菌圈处于10～15 mm 之间，属于中度敏感；且抑制作用强弱顺序依次为：大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>啤酒酵母>沙门氏菌>黑曲霉。综上所述：金柑果皮精油具有广谱抗菌性，有广阔的应用前景。

由表5可知，随着精油浓度的降低，其对受试菌的抑制作用逐渐减弱。其中金柑果皮精油对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为1.0%，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.5%，对沙门氏菌的最小抑菌浓度为0.5%，对黑曲霉的最小抑菌浓度为0.5%，对啤酒酵母的最小抑菌浓度为0.1%。植物精油的MIC越小，其抑菌活性越强。综合上述实验结果，金柑果皮精油对啤酒酵母的抑制性最好。刘笑宇[18]研究结果表明，肉桂精油对酵母菌的较好，其MIC小于其他受试微生物，这与本实验结果相一致。

2.4 抗氧化试验

2.4.1 金柑果皮精油添加量对油脂抗氧化效果的影响 由图8～9可以看出，4组猪油样品和橄榄油样品的POV值均随着时间的增加而变大，但添加了金柑果皮精油的橄榄油和猪油的POV值与空白相比均有下降，添加量越大，相同氧化时间油脂的POV值就越小，表明金柑果皮精油对2种油脂具有抗氧化延长储藏期的效果，且添加量越大效果越明显。金柑果皮精油对猪油和橄榄油均具有良好抗氧化作用，可能是由于金柑精油中富含醛類物质和萜烯类化合物[6]，其含有双键结构，在贮存过程中先于油脂被氧化从而减缓了油脂的氧化过程。金柑果皮精油对橄榄油的抗氧化作用好于猪油。由图9可知，随着时间的推移精油添加量越高，其对橄榄油的抗氧化效果越好。

2.4.2 金柑果皮精油体外抗氧化的研究 由图10可知，金柑果皮精油具有较高的抗氧化性；金柑果皮精油对DPPH自由基清除率能达到82.5%，明显高于Vc对DPPH自由基的清除率；抑制羟自由基能力达到42.71 U/mL，略低于Vc对羟自由基的抑制能力；总抗氧化能力达到9.00 U/mL，明显低于Vc的总抗氧化能力。DPPH自由基是一种稳定的自由基，被广泛用于评价抗氧化物的体外抗氧化能力。植物精油中α-蒎烯、萜品烯、百里酚等组分可阻断氧化反应的自由基链，使自由基形成稳定状态从而具有清除DPPH自由基的能力。傅维擎等[7]对金柑果皮精油功能团鉴定结果表明，金柑果皮精油含有醇类、醛酮类、不饱和脂肪酸，不含酚类、羧酸衍生物。其中α-蒎烯相对含量为4.31%，月桂烯相对含量为6.88%，β-蒎烯相对含量为3.6%，D-柠檬烯相对含量为72.9%。金柑果皮精油中α-蒎烯、柠檬烯等活性成分与自由基进行反应，使自由基形成稳定状态的成分。由于精油中含有多种活性成分，其清除DPPH自由基能力应该是各组分清除活性的加和作用结果；其自由基清除能力显著高于Vc，可能是由于各活性成分起到了协同作用[17]。综上所述，金柑果皮精油对DPPH自由基具有良好的清除作用，有一定的抑制羟自由基和总抗氧化能力。

3 讨论

超声波辅助提取精油具有简单高效等优点，王娟等[16]利用超声波辅助提取茶树花精油，结果显示其他因素固定时，茶树花精油的得率随着超声时间增加而增大，但达到一定值后，提取率随着超声时间的增加而略有降低；这与本实验结果相一致。李佳桥等[19]利用响应面优化超声波辅助提取原花青素，结果显示，液料比和超声波功率对原花青素提取率影响较为显著，超声时间次之；这与本实验结果相吻合。

章斌等[8]研究柠檬果皮精油对几种微生物的抑制强弱顺序为：大肠杆菌>枯草芽孢杆菌>金黄色葡萄球菌>黑曲霉>根霉>酿酒酵母；Wang等[20]研究表明Crassifolia金桔果皮精油对微生物的抑制强弱顺序为：大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌。对比以上二者研究，本实验中金柑果皮精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用与以上二者的研究相一致，但MIC值略高于以上两者。

Nouri等[21]研究表明伊朗金柑果皮精油对DPPH自由基有一定的清除能力。章斌等[8]证实柠檬果皮精油对猪油和花生油的贮藏期有一定的延缓作用，对羟自由基的清除能力最强，对DPPH自由基的清除能力次之。张蕾[11]研究也表明遂川金柑果皮精油对羟自由基清除能力最强，对DPPH自由基的清除能力弱于Vc。本实验中金柑果皮精油对猪油的抗氧化能力、羟自由基的清除能力与上述研究结果相符；但对DPPH自由基的清除能力和以上三者实验有一定程度的差别，究其原因可能是由于金柑品种或提取方法不同造成的精油成分差异所致，更深层次的原因有待进一步实验探明。

本实验以石油醚为萃取剂，以金柑果皮精油得率为指标，探究了液料比、超声时间、超声波功率对金柑果皮精油得率的影响，结果表明最优提取工艺条件为：液料比27 ∶ 1 mL/g，超声时间1.25 h，超声波功率300 W，以此条件下，金柑果皮精油得率达（2.24±0.02）%。金柑果皮精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌性较高；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、黑曲霉、酿酒酵母菌的最小抑菌浓度分别为1.0%、0.5%、0.5%、0.5%、0.1%。抗氧化活性实验结果表明，金柑精油在食用油脂中具有良好的抗氧化活性，对DPPH清除率能达到82.5%，抑制羟自由基能力达到42.71 U/mL，总抗氧化能力达到9.00 U/mL。

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