辐射花粉诱导木薯无融合生殖及鉴定研究

孙琪 陈霞 贾泽冲 刘云豪 赖杭桂 陈松笔 朱文丽

摘 要 花粉诱导是获得无融合生殖的一个重要途径。本试验采用辐射花粉对雌花授粉进行木薯无融合生殖活体诱导，获得了由60Coγ射线辐射花粉诱导的孢子体无融合生殖种质。结果表明：60Coγ射线辐射花粉诱导木薯无融合生殖的途径是有效的，且辐射剂量及品种的选择对木薯无融合生殖诱导具一定的影响。本次试验共收获23株植株，通过对诱导子代的细胞学及共显性EST-SSR分子标记检测，显示其23株诱导子代为杂合二倍体；进一步采用SRAP分子标记对各子代的异质杂合性或同质杂合性鉴定，发现2株为SC5遗传同质体。

关键词 木薯；辐射花粉；无融合生殖；倍性鉴定；分子标记

中图分类号 S533 文献标识码 A

Induction and Identification of Apomixis

by Radiation Pollen in Cassava

SUN Qi1， CHEN Xia1， JIA Zechong1， LIU Yunhao1， LAI Hanggui1 *， CHEN Songbi2， ZHU Wenli2

1 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract Pollen induction is an important way to obtain apomixis. In this study， the pollen which radiated was used to pollinate with female flowers for inducing cassava apomixis in the living body， and acquired the sporophyte apomixis germplasmthe induced by the pollen that radiated under 60Coγ-ray. The results showed that： The way to induce cassava apomixis by 60Coγ-ray radiation pollen was effective， and the choice of radiation dose and variety had a certain influence on the induction of cassava apomixis. A total of 23 plants were harvested in this study， and the offsprings were detected by cytological and codominant EST-SSR markers， it showed that the 23 offsprings were heterozygous diploid； Furthermore， SRAP molecular markers were used to identify heterozygous heterozygosity or homozygous heterozygosity for each progeny， and two offsprings were found to be genetic homogeneity of SC5.

Key words Manihot esculenta Crantz； radiated pollen； apomixis； ploidy identification； molecular markers

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.001

无融合生殖（Apomixis）是指不经过精卵融合即可形成胚从而进行种子繁殖的方式， 是一种可介于有性生殖和无性生殖的特殊的生殖方式[1]。无融合生殖可分为无孢子生殖、孢子体无融合生殖和配子体无融合生殖三种类型，无孢子生殖和孢子体无融合生殖由胚珠细胞或大孢子母细胞有丝分裂形成胚囊，可产生与亲代一致的体细胞遗传同质体，即二倍体无性种子；而配子体无融合生殖是指卵细胞未经过受精过程而形成胚并发育为个体的生殖方式，产生的个体多为单倍体，加倍后可获得稳定一致的纯合二倍体。因此，不同类型的无融合生殖遗传特性在固定杂种优势、缩短育种年限、提供单倍体材料、积累优良基因等具重要的生产意义和育种价值[1-2]。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是全球三大塊根作物之一，是热带及亚热带地区重要的经济及能源作物。由于木薯为异花授粉，基因型高度杂合，生产上主要通过其种茎进行无性繁殖。木薯的无融合生殖不仅能固定高度杂合的基因型，积累和传播植物的优良基因及简化杂交制种方法，对于具有高营养的薯类等农作物，通过无融合生殖还可切断病毒的传播[3]；若通过孤雌生殖创制单倍体或纯合二倍体材料，则对木薯遗传图谱构建、基因差异表达、QTL性状定位等分子生物学研究具有重大意义。据相关研究报道，木薯的无融合生殖可通过种间杂交产生，Nassar和Freitas等相继发现了木薯栽培种与野生种杂交后代无融合生殖现象的存在，并证实了木薯的兼性无融合生殖属性，在胚胎学鉴定中发现其珠心为多胚结构，并且受环境高度影响[3-7]。

育种实践证明，花粉诱导是获得植物无融合生殖的一个有效途径，失活或变异花粉授粉后可以提高子房内激素水平，使果实膨大，促进种子发育[8]。李春秋等[9]曾采用风干后的花粉诱导获得玉米无融合生殖植株。Bekir等[10]应用核桃失活花粉与鲜苹果花粉对Tokat-1核桃进行混合蒙导授粉，无融合生殖座果率达6.4%。此外，研究者在核桃、苹果、黄瓜、甜瓜等多种作物上进行了辐射花粉授粉诱导，并获得了单倍体后代[11-14]。本研究通过60Coγ射线辐射木薯花粉，采用辐射后的花粉与木薯雌花授粉，对授粉后雌花发育进行观察，统计比较不同辐射剂量及不同品种处理后稔实率和坐果率的差异，对诱导子代进行细胞学鉴定及分子标记检测，成功筛选出木薯遗传同质体无融合生殖种质。这对木薯生殖发育特性及无融合生殖育种研究具有重要意义，并可能为进一步诱导木薯卵细胞孤雌生殖途径提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为木薯华南5号（SC5）、华南7号（SC7）、华南10号（SC10） 3个栽培品种，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。于2016年3月种植采用种茎无性繁殖方式种植于海南大学儋州校区农科基地，每品种种植100株，株行距为1.0 m×1.5 m。试验所用引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 花粉诱导无融合生殖方法 开花前1 d采集木薯供体材料的雄花（SC5、SC7、SC10），装入防水纸袋，雄花在海南金原新技术有限公司进行60Coγ射线辐射（辐射剂量梯度为500～600、800～900 Gy）处理后，将雄花进行低温干燥保存。当天上午9 ： 00左右选择即将开放的雌花进行套袋隔离，于下午13 ： 00～14 ： 00用辐射过的雄花对SC5、SC10刚开放的雌花柱头进行异品种授粉后套袋隔离，并挂牌标记亲本组合、数量和日期。授粉2～3 d后解除套袋，开花后7～10 d子房膨大且形成幼果时统计稔实率，100 d左右收获成熟果实并统计其坐果率，收集种子播种于育苗盘中。

1.2.2 花粉诱导子代倍性鉴定 采用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪（Flow Cytometry）对诱导子代植株叶片的DNA含量快速检测，使用CellQuest Pro软件进行分析。木薯嫩叶细胞染色体观察参照张健等[15]木薯叶片染色体制片技术，具体流程为：取材时间为上午8 ： 30～10 ： 00，用0.1%秋水仙素与0.002 mol/L 8-羟基喹啉混合液室温预处理3 h，经固定液（无水酒精 ∶ 氯仿 ∶ 冰醋酸=6 ∶ 3 ∶ 1）固定，用1 mol/L盐酸60 ℃下解离8 min，再用改良苯酚品红染色压片镜检，可取得良好的分裂相效果。

1.2.3 EST-SSR分子标记鉴定纯合体和杂合体

利用EST-SSR特异性地代表一个基因的“表达序列标签”，对木薯诱导子代的纯合性和杂合性进行鉴定。首先，以亲本DNA作为模板，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选出呈现共显性的EST-SSR标记引物，以显示为2条带对应1对杂合等位基因。再以子代的DNA作为模板，用筛选好的标记引物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将扩增出的条带与亲本的条带进行比对，由于SSR为共显性遗传，所以扩增出2条带的视其为杂合，扩增出1条带的视其为纯合[16-17]。具体操作参照韦祖生等[18]木薯EST-SSR标记方法。

1.2.4 SRAP分子标记鉴定异质杂合性或同质杂合性 利用SRAP对木薯诱导子代和亲代的多态性标记进行比较检测，可对木薯无融合生殖的异质杂合性或同质杂合性进行鉴定。具体步骤参照齐兰等[19]木薯SRAP标记方法稍加改进：①采用改良CTAB法提取叶片基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性及浓度，稀释到工作液浓度20 ng/μL，保存在-20 ℃冰箱中备用；②用亲本DNA对64对SRAP引物进行筛选，筛选出目的引物后依据SRAP反应体系（共20 μL，含2×PCR mix 10 μL、ddH2O 6 μL、Forward primer 1 μL、Reverse primer 1 μL、DNA模板2 μL）对子代DNA进行PCR扩增，扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测；③取8 μL PCR产物点样，用1倍TAE缓冲液，在100 V电压下电泳40 min后，用凝胶成像系统进行拍照检测。

1.3 数据处理

采用MS Excel软件对数据进行处理，使用SPSS 17.0，DPS7.05软件进行方差分析以及多重比较分析。数据显著性差异分析采用Student-Newman -Keulq法、u测验和t测验等进行比较，水平为p =0.05、p=0.01。釆用标记字母的多重比较结果表示方法标出各差异显著性。

2 结果与分析

2.1 辐射花粉诱导木薯无融合生殖稔实率和坐果率的统计

2.1.1 不同辐射剂量的花粉诱导对木薯无融合生殖频率的影响 如表1所示，自然授粉的木薯雌花（CK）稔实率及坐果率极显著高于辐射诱导的稔实率及坐果率，经60Coγ射线辐射后的花粉用以雌花授粉造成稔实率及坐果率大幅降低；而辐射剂量的大小对木薯的稔实率和坐果率也有较大影响，其中500～600 Gy辐射花粉要显著高于800～900 Gy辐射花粉诱导的稔实率和坐果率，说明较低的辐射剂量更有利于授粉后木薯子房的生长发育。而随着辐射剂量的增大，诱导后木薯的稔实率和结实率降低，说明随着辐射剂量的增加会引起花粉变异加大，而鉴定结果则显示较高剂量的辐射更有利于无融合生殖的诱导。

2.1.2 不同品种对辐射花粉诱导无融合生殖频率的影响 表2统计结果所示，用辐射后的木薯花粉对SC5和SC10两个品种进行授粉，授粉后SC5的稔实率和坐果率显著高于SC10的稔实率和坐果率。试验表明，在采用物理方法60Coγ射线处理花粉诱导木薯无融合生殖时，不同基因型的材料不仅对诱导无融合生殖稔实率和坐果率产生影响，且之后筛选出的无融合生殖种质来源于SC5品种，因此诱导过程中对品种材料的选择是必要的。

2.2 花粉诱导子代出苗率统计

本次试验收集誘导后的木薯种子共83粒，按粒播种于育苗盘正常管理，共有23株出苗，其中SC5有14株，SC10有9株。出苗率为27.7%。图1 为辐射花粉诱导获得的木薯无融合生殖子代植株。

2.3 木薯诱导子代的倍性鉴定

对23株木薯辐射花粉诱导的子代种苗的叶片进行流式细胞术及染色体倍性检测，鉴定结果表明，23株花粉诱导子代均为二倍体，叶片DNA含量与正常二倍体对照相同，体细胞染色体数2n=2x=36（图2）。该批子代植株中未发现单倍体或多倍体。

2.4 EST-SSR标记鉴定子代的纯合性

2.4.1 EST-SSR引物筛选 以SC5和SC10作为模板对159对木薯EST-SSR标记引物进行筛选，共筛选出6对引物，对应6对等位基因，因此可以选择该6对引物来鉴定木薯辐射花粉诱导子代的基因型纯合性。表3为筛选的6对EST-SSR引物及其扩增条件。

2.4.2 诱导子代植株的纯合性鉴定 利用筛选出的6对条带清晰的双条带EST-SSR引物对23株子代植株的纯合性进行鉴定。结果显示，14株SC5及9株SC10的诱导子代在6对引物中均扩增出相应的双条带型，这表明在该6对等位基因位点表现为杂合基因型，可知这23株木薯诱导子代均为杂合体植株，没有出现单条带型的卵细胞孤雌生殖单倍体或纯合二倍体植株。图3为引物CESR-0831 对SC5诱导子代的鉴定结果，图4为引物CESR-0604对SC10诱导子代的鉴定结果。

2.5 SRAP分子标记鉴定异质杂合性或同质杂合性

2.5.1 SRAP引物筛选 利用SC5和SC10作为模板对64对木薯SRAP标记引物进行PCR扩增。其中SC5作为模板筛选出稳定性好、条带清晰且有差异扩增的18对引物，以SC10作为模板筛选出了15对条带清晰且多态性明显的引物。SRAP标记引物筛选结果见表4。

2.5.2 诱导子代的SRAP标记鉴定 利用18对SC5及15对SC10筛选出的SRAP标记引物对23 株诱导子代进行分子标记鉴定，结果发现：14株SC5的诱导子代中有12株与亲本SC5带型具明显差异，其中2株由800～900 Gy 60Coγ射线辐射诱导的子代与亲本SC5带型一致；而SC10的9株诱导子代均与亲本SC10的带型具明显差异（图5、6）。由此可以判断本试验60Coγ射线辐射花粉诱导获得了2株与亲本SC5基因型一致的遗传同质体，该2株遗传同质体为木薯的无融合生殖途径产生，无融合生殖在诱导子代的发生频率为8.7%。

3 讨论

采用物理或化学及生物学方法诱导植物无融合生殖已有许多成功事例[20]，但木薯无融合生殖的人工干预诱导国内外鲜有报道。在通过种间杂交获得木薯无融合生殖种质报道中，Nassar[21]认为，木薯的无融合生殖可能由于发生不正常的减数分裂所导致，或由于其他因素激活木薯中的某些基因，这些基因会使一些位于珠心或有性胚囊内的体细胞发育形成无孢子生殖胚囊，从而形成了木薯的二倍体孢子生殖或无孢子生殖类型的兼性无融合生殖现象。由于木薯自然无融合生殖频率极低，进行人工干预提高木薯无融合生殖频率具备较好的应用前景。

不同植物在无融合生殖的机理方面存在很大差异，无融合生殖诱导会受多重因素的影响，如不同诱导技术、不同基因型材料、不同生育期、浓度剂量、外界环境因素等[22]。本试验过程证实，木薯花粉辐射后诱导无融合生殖受辐射剂量和不同品种材料的影响，60Coγ 800～900 Gy剂量的诱导效果优于500～600 Gy，且SC5品种诱导效果优于SC10。所以，适宜辐射剂量的筛选及品种材料的选择是必要的，这与许多相关研究观点一致，如γ射线照射番茄花粉的有效剂量为5 000～7 000 R、小麦5 000～8 000 R、烟草5 500 R，X射线照射烟草的有效剂量为1 500 R[17]；而在甜瓜、黃瓜、核桃、胡杨等辐射花粉的诱导表明，不同基因型材料的差异会影响无融合生殖的诱导频率[8， 23-25]。

由于无融合生殖类型多样，所发生的机制也极为复杂，辐射花粉诱导大多应用于单倍体育种[11-14]，目前辐射花粉诱导技术机制还不完全清楚，无融合生殖遗传同质体的产生主要来源于无孢子生殖或二倍孢子体生殖途径，其基因型与亲本相同，子代继承了亲代固有的遗传特性，形成遗传上稳定的可由种子繁殖的胚囊体细胞或孢原细胞的无性后代[26]。另外，试验过程出现21株带型与亲本对照具明显差异的二倍体诱导子代，经EST-SSR检测并未发现纯合体现象，因此该21株可判断为异质杂合体，即由正常杂交所产生的杂种子代。不排除辐射后变异花粉也有可能参与受精，导致出现异质杂合体现象，或者与木薯的兼性无融合生殖有关[3]。

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