回药“失荅剌知丸”对大鼠脑缺血再灌注后Delta样配体4表达的影响△

李占涛 贾孟辉 苏 丹 左艳丽 于凌志 黑晓英 李宏伟

( 1． 宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004； 2． 宁夏医科大学第二附属医院，宁夏 银川 750001； 3． 回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

回药“失荅剌知丸”对大鼠脑缺血再灌注后Delta样配体4表达的影响△

李占涛1，3贾孟辉2，3*苏 丹1左艳丽1于凌志1黑晓英1李宏伟1

( 1． 宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004； 2． 宁夏医科大学第二附属医院，宁夏 银川 750001； 3． 回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

目的：探讨失荅刺知丸对大鼠脑缺血再灌注后Delta样配体4表达的影响。方法：将102只SD大鼠随机分为17组，每组6只，分别为：空白组、假手术组、模型组、尼莫地平组、失荅剌知丸低剂量组、失荅剌知丸中剂量组、失荅剌知丸高剂量组，其中模型组和给药组又根据再灌注时间分为1d、3d、7d组。 以上各组除空白、假手术组外，均采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO)。各组在观察饲养相应天数后取材，采用蛋白免疫印迹法(Western blot)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，测定脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中Delta样配体4的相对表达情况。结果： Western blot、PCR结果显示，与模型组相比，失荅剌知丸各组Delta样配体4表达显著升高，与尼莫地平组比较，失荅剌知丸高剂量组Delta样配体4的表达显著增高(P<0.05)。结论：失荅剌知丸对脑缺血大鼠再灌注后损伤脑组织中的Delta样配体4表达有促进作用，可能是失荅剌知丸治疗脑缺血再灌注的重要机制之一。

失荅剌知丸；脑缺血再灌注；Delta样配体4；回回药方

脑卒中(stroke)，又被称为中风或脑血管意外(cerebrovascularaccident)，是世界三大致死疾病之一。[1]20年来,随着人口增长和老龄化冲击，我国脑卒中发病率正以每年9%的速度上升，其中以缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)居多，约占85%以上。因其高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率等特点，给个人和社会带来巨大的负担，严重威胁我国人民健康及社会发展。研究表明，缺血性脑卒中的病因复杂。治疗以恢复神经功能；减少脑缺血再灌注损伤所引起的细胞凋亡；促进缺血后血管修复为原则。其中促进受损血管修复，恢复缺血区的血流供应，尤为关键。本研究是在回药经典方 “失荅刺知丸”能够有效治疗缺血性脑血管病的基础上，应用线栓法制备大鼠MCAO模型，予以失荅剌知丸治疗后，检测大鼠脑缺血再灌注后损伤脑组织内Delta样配体4 的表达，对该方发挥治疗作用的机制进行初步的探讨。

1 材料

1.1 实验动物及分组:SD雄性大鼠102只，鼠龄3～4个月，体重为230±20g，由宁夏医科大学实验动物中心提供。大鼠于同一动物房中饲养，温度25±l℃，湿度50±10 %，光暗周期12h/12h，自由进食与饮水；适应性饲养7d后进行实验。随机将6只大鼠归为一组，分为：空白组，假手术组，模型1d、3d、7d组，尼莫地平1d、3d、7d组，失荅剌知丸高剂量1d、3d、7d组，失荅剌知丸中剂量1d、3d、7d组和失荅剌知丸低剂量1d、3d、7d组。

1.2 实验药物及试剂1.2.1 实验药物：失荅剌知丸：柴胡31g、黑诃子31g、撒额冰(阿魏)9g、芦荟 62g 、白芥子9g、失荅剌知(血根草)6g、沙哈木罕荅里(药西瓜)9g、胡椒3g 、安息香9g、巴豆霜9g、菖蒲6g、番盐6g、阿里公(松蕈)9g、干姜9g 、荜茇9g 、芸香9g；药物由宁夏医科大学第二附属医院药剂科提供。参照大鼠体表面积剂量换算系数公式，计算给药剂量；将生药材去除杂质，切制后，按组方剂量配比，加入生药材10倍量的水，浸泡60 min后用TC—15套式恒温器250V电压加热煎煮；安息香、阿魏后下，沸腾后将电压调低至150V，保持微沸状态煎煮30 min，滤取煎液；药渣再加入生药材8倍量的水，浸泡30 min后煎煮，保持微沸状态煎煮30 min，滤取煎液；合并2次煎液，将药液用恒温水浴锅(100℃)浓缩至每1mL水煎剂中分别含生药4.5g、3.0g、1.5g，即失荅剌知丸方高剂量为4.5g/mL、中剂量为3.0g/mL、低剂量为1.5g/mL，相当于临床等效剂量的3倍、2倍、1倍。置冰箱4℃保存备用。

尼莫地平片：由拜耳医药保健有限公司提供(规格：20mg×50片，批号：H23021402)。将尼莫地平研碎加水配成浓度为1.08g/L的混悬液备用。

1.2.2 试剂：造模：10%水合氯醛、酒精等。Western blot:全蛋白抽提试剂盒、SDS-PAGE 凝胶电泳试剂盒、WesternBlotting 检测试剂盒、ECL 检测试剂盒、Braford 蛋白含量检测试剂盒、预染蛋白分子量、丽春红染色液、显色液、定影液、 Dll4兔多抗等。 RT-PCR:超纯RNA提取试剂、反转录试剂盒、Real-time PCR 试剂盒、5x RNA Loading Buffer等。以上试剂均购自兴庆区西宝生物科技有限公司。

1.3 造模及给药

1.3.1 造模：参照改良的Longa[2]法用线栓阻塞大鼠左侧大脑中动脉制备局灶性脑缺血动物模型。术前大鼠称重，按0.3mL/100g剂量以10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，60W白炽灯照射，保持大鼠肛温在37℃。大鼠仰卧位固定，颈部常规消毒，切开皮肤，钝性分离组织、肌肉，暴露左侧颈总动脉(CCA)，分离颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)，电凝甲状腺上动脉、枕动脉等小动脉。颈总、颈内动脉挂粗线，结扎ECA近心端、远心端，从中间剪断。于颈外动脉近分叉处用眼科剪开一小口，牵拉颈外动脉残端与颈内动脉成一直线，将线栓从颈外动脉上的小口插入，放松颈内动脉，将线栓插至有阻塞感，插入深度18±2mm。结扎线栓与颈外动脉残端以固定线栓，防止其脱落或插入过深。松开CCA，线栓随颈总动脉搏动，表示颈内动脉未完全阻塞，示插线成功。缝合皮肤，移至笼中待自然苏醒。再灌注：在置入栓线2h后再次麻醉，剪开创口，由露出的栓线尾部将栓线柔和地抽出，当栓线球面前端退至ECA结扎线时遇到阻力，此时停止拔线，剪除栓线的残端，缝合皮肤，消毒创面。大鼠清醒后自由进食、饮水。

1.3.2 给药：空白组、假手术组及模型组以生理盐水灌胃2次/d；尼莫地平组给予1.08g/L尼莫地平混悬液灌胃；失荅剌知丸低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予浓度1.5g/mL、3.0g/m、4.5g/mL的失荅剌知丸水煎剂。大鼠灌胃剂量为1mL/100g。给药组分别在制作脑缺血再灌注模型前30 min予以第1次灌胃，造模成功后每天灌胃2次。

1.4 动物模型评价及取材：再灌注2h后对模型进行评价：右侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；倒悬时左上肢向胸前屈曲；行走时身体向右侧倾倒或向右转圈；右侧出现Honer’s症为造模成功。排除无神经损伤症状；蛛网膜下腔出血；镜下观察无缺血病理改变；未到观察时间点死亡的动物模型。

于各组指定饲养时间后断头剥取脑组织：大鼠麻醉后放于冰袋上打开胸腔，暴露心脏，经心尖搏动处插管，用0.9%的生理盐水300mL快速冲洗，肝脏变白后迅速在冰上断头，剥取完整全脑，滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和低位脑干，取5mm厚的脑组织置于冻存管内，液氮保存备用Western blot和RT-PCR检测。

1.5 Western blot：常规方法提取缺血脑组织蛋白，用BCA法进行蛋白定量，再行SDS- PAGE电泳分离蛋白,取25μg样品，以12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用半干电转移法转移到 PVDF 膜上，5% BSA封闭，兔抗大鼠Delta4单克隆抗体稀释比例1∶1000，4℃下摇床孵育2h。山羊抗兔二抗1∶3000比例稀释，β-actin稀释比例1: 1000，4℃下摇床孵育1h。洗膜后以目的蛋白条带灰度与内参β-actin条带灰度的比值表示蛋白的表达水平。显色后，对图像进行分析。

1.6 RT-PCR实验步骤 ：用TRIzol一步法提取 RNA，超纯RNA提取试剂(TaKaRa Code D9108B)提取组织样本中总RNA。取5μLRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用反转录试剂盒中的gDNA Eraser (TaKaRa code DRRO47A)对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理。用反转录试剂盒(TaKaRa code DRRO47A)进行反转录，Delta4引物序列上游5'- ATGCTCGCCAAGTACCCATC -3',下游5'- TAGGCCCAAAACAGCAACCA -3'，扩增片段长度为146bp。进行扩增：取0.5mLPCR管，依次加入第一链cDNA-2μL、上游引物(10pM)-2μL、下游引物(10pM)-2μL、dNTP(2mM)-4μL、10×PCR buffer-5μL、Taq酶(2u/μL)-1μL等试剂。加入适量的ddH2O，使总体积达50μL，轻轻混匀，离心。设定PCR程序:95°30秒，(95℃ 5sec，60℃ 34sec)×40个循环。用凝胶分析软件Quantity one 进行定量分析。

1.7 统计学方法：实验数据采用SPSS17.0统计软件分析处理，计量资料以(±s) 表示，组间比较应用单因素方差分析，多组间比较方差齐时用LSD法进行均数间两两比较，p<0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

失荅剌知丸对大鼠脑缺血再灌注后Delta样配体4表达的影响： Western blot结果提示：模型组与各药物组Delta样配体4表达均有不同程度的提高；与空白组和假手术组比较，模型组Delta样配体4的表达增强(P<0.05)；与模型组比较，各给药组Delta样配体4的表达显著提高 (P<0.05)；尼莫地平组与失荅剌知丸中剂量组比较无统计学差异(P>0.05)，尼莫地平组与失荅剌知丸组比较，失荅剌知丸高剂量7d组Delta样配体4的表达显著增高(P<0.05)；失荅剌知丸同剂量组1d、3d、7d比较，Delta样配体4的表达随治疗时间增加而增强 (P<0.05)。RT-PCR结果显示Delta样配体4 mRNA的表达同蛋白表达趋势相一致。

表1 Western blot检测相对定量结果

表2 Real-Time PCR检测相对定量结果

3 讨论

Notch/Delta 通路是广泛存在于脊椎和非脊椎动物中的重要信号传导通路，Delta样配体4是5种Notch配体(DLL1、 DLL3、 DLL4、 Jagged1、Jagged2)中的一种[3]。Notch信号参与缺血后损伤血管的修复，低氧使其表达上调，与临近细胞上相应受体notch1、4相互作用启动细胞内信号传导，激活下游Notch靶基因的转录，从而调节血管的生成和分支过程。[4]Delta样配体4活性的表达是缺血性脑卒中的一个重要治疗目标，因此寻找有效的促进Delta样配体4表达的方法及药物已成为治疗脑缺血损伤的一个重要方向。

中国回族医学对脑生理、病理认识独到：认为脑统百脉、主情志思维活动；认为湿浊太重是该病夙根，强调以芳香论治。[5]失荅剌知丸出自《回回药方》，是治疗脑病的经典方之一。原方谓“专治骨节疼痛，左瘫右痪，口眼歪斜，半身不遂，能开缠肠肚风病，最通经络。”[6]方中诸药合璧，标本兼治，能通利脑经、开窍醒脑、又逐瘀消痰。既往研究[7-10]已证明“失荅剌知丸”对于脑缺血再灌注损伤具有显著的的治疗作用，已从神经保护和抑制细胞凋亡等方面进行了研究。本研究在既往研究的基础上，进一步阐述失荅剌知丸治疗脑缺血疾病的作用机制。研究结果提示Delta样配体4表达上调，说明激活Notch/Delta 信号通路可能是失荅剌知丸治疗脑缺血再灌注的重要机制之一。

[1]Perju - Dumbrava L，Muntean ML and Muresanu DF． Ce-rebrovascu - lar Profile Assessment in Parkinson＇s DiseasePatients[J]． CNS Neurol Disord Drug Targets，2013.

[2] Longa EZ. Weinsten PR, Carlsom S. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat[J].Stroke.1989,20(1)84-91.

[3] 郎志强，曲桂梅．DLL4与血管生成的关系[J]．临床与实验病理学杂志，2011，27(9):974-975．

[4] 郭晓强，郭振清． Delta样配体4与血管生成[J].生命的化学，2007,27(3):195-196.

[5] 甘佳乐.回族医学对中风的认识及治疗研究进展[J]．中国实验方剂学杂志,2016,1(1):22.

[6] 宋岘．回回药方考释[M]．北京: 中华书局，2007.

[7] 刘丽.荅刺知丸对脑缺血再灌注大鼠海马神经元形态学和 Caspase-3、Caspase -9 表达的影响 [J].辽宁中医杂志，2015，42(1):184-189.

[8] 刘丽.荅刺知丸对大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积及海马区神经生长因子表达的影响 [J].宁夏医科大学学报 ，2011，36(11):1185-1188.

[9] 王佩佩.失荅剌知丸对脑缺血大鼠再灌注后神经功能缺损及脑组织 PI3 -K和 AKT表达的影响[J].宁夏医科大学学报， 2014， 36(5):473-477.

[10] 于凌志.核转录因子 NF-KB 对脑缺血再灌注干预机制的研究进展[J].中国民族医药杂志,2015(7):42-44.

2016年12月29日收稿

Effect of "Shida Lazhi Wan" on Expressions of Delta-like Ligand 4 in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

LI Zhantao1,3JIA Menghui2,3Su Dan1ZUO Yanli1YU Linghi1HE Xiaoying1LI Hongwei1

(1. College of Traditional Chinese Medicine, Ningxia Medical University, ,Ningxia 750004, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750001, Ningxia, China; 3. Ministry of Education Key Laboratory of Modernization of Ministry of Education, Yinchuan 750004, China)

Objective:To investigate the effects of Shida Lazhi Wan on the expression of Delta-like ligand 4 after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Methods: 102 SD rats were randomLy divided into 17 groups (6 rats in each group): blank group, sham operation group, model group, nimodipine group, low dose group, The middle dose group and the high dose group. The model group and the administration group were divided into 1d, 3d and 7d groups according to the reperfusion time. The rats in each group were divided into sham operation group and sham operation group. The focal cerebral ischemia-reperfusion model (MCAO) was made by the method of thread embolization. The expression of Delta-like ligand 4 in the brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury was detected by Western blot and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) Relative expression. Results: Compared with the model group, the expression of Delta-like Ligand 4 was significantly increased in the group treated by Western blot and PCR. Compared with the nimodipine group, the Delta-like (P<0.01). Conclusion: Shida Lazhi Wan can promote the expression of Delta-like Ligand 4 in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury, which may be one of the important mechanisms of Shida Lazhi Wan in treating cerebral ischemia-reperfusion.

Shida Lazhi Wan; Cerebral ischemia reperfusion; Delta-like ligand 4;

国家自然科学基金( 81560816)

李占涛( 1990 - ) ，男，在读硕士研究生。研究方向: 中回医学防治心脑血管疾病的理论和临床研究。E-mail:360224483@ qq.com

* 通讯作者: 贾孟辉( 1962 - ) ，男( 汉族) ，陕西咸阳人，现任宁夏医科大学第二附属医院主任医师，硕士研究生导师，“国家十二五临床重点专科”— “回医药脑病专科”项目负责人，国家自然基金课题项目评议专家，研究方向: 中医药、回医药防治心脑血管疾病的理论和临床研究。

R291.3

A

1006-6810(2017)02-0058-04