临床鼻-鼻窦表皮葡萄球菌菌株体外细菌生物膜培养观察

谢慧 俞菲 李玲珑 窦豆 文东萍 曹刘

·实验研究·

临床鼻-鼻窦表皮葡萄球菌菌株体外细菌生物膜培养观察

谢慧 俞菲 李玲珑 窦豆 文东萍 曹刘

目的 统计优势菌种为表皮葡萄球菌的例数分别在慢性鼻-鼻窦炎(CRS)患者、健康人中所占比率，对比两组表皮葡萄球菌体外培养后细菌生物膜产膜率以及产膜强弱。方法 分组采集在临床确诊为慢性鼻-鼻窦炎患者、健康人中鼻道分泌物，对分泌物送检进行优势菌种鉴定，将优势菌种为表皮葡萄球菌的菌株分别进行分离、保种；通过刚果红平板法筛选生物膜阳性菌株和结晶紫染色法半定量检测生物膜产膜强弱程度。结果 共收集39例中鼻道分泌物，其中CRS 20例，健康人19例；刚果红平板法生物膜阳性菌株有11株，其中CRS 9株，健康人2株；结晶紫染色法半定量所得结果与刚果红所测结果相同。结论 表皮葡萄球菌在CRS需氧菌种中所占比率最大，CRS患者表皮葡萄球菌菌株体外培养成膜率明显高于健康人,CRS患者表皮葡萄球菌临床菌株体外培养生物膜产膜能力强于健康人。

表皮葡萄球菌; 体外培养; 细菌生物膜; 慢性鼻-鼻窦炎

慢性鼻-鼻窦炎(CRS)是耳鼻喉科最常见慢性疾病之一，2012年美国成人健康数据统计报告:全国健康访问调查显示在过去一年中回顾性访问调查中显示患有鼻窦炎的成年患者约占12%[1]。本病的发病机制尚未完全明确，一般观点认为细菌感染被认为是其中重要的因素之一。CRS的诊断要点之一是病程超过3月，而近些年发现细菌生物膜形态下细菌的耐抗生素能力是普通细菌的10到100倍，并逐渐认识到细菌生物膜成为一些疾病迁延成为慢性疾病的主导因素[3-6]。葡萄球菌是造成高发病率院内感染的主要原因之一，而表皮葡萄球菌菌株引起院内抗生素耐药感染[1-2]表皮葡萄球菌在CRS患者鼻腔分泌物细菌分离鉴定中占13.2%～50.2%，比例均是最高[7-8]。但对于表皮葡萄球菌在CRS患者中细菌生物膜表达的研究还相对较少，因此本研究将观察各类样本中优势菌种及鼻腔临床分离株的表皮葡萄球菌产膜率。

1 材料与方法

1.1 材料

治疗组：选取成都中医药大学附属医院门诊经确证为CRS的患者20例。对照组：成都中医药大学及附属医院的健康者19例。以无菌棉签在内窥镜引导下在CRS患者中鼻道处旋转棉签3周左右沾取分泌物放入装有无菌转运液的EP管中。(采样时间：2015年12月1日至2016年11月30日)

1.1.2 菌株

试验菌株：鼻-鼻窦表皮葡萄球菌临床分离株，由成都中医药大学附属医院检验科微生物室按照常规方法进行需氧菌培养、分离，通过法国生物梅里埃全自动微生物鉴定系统(型号VITEK®compact)鉴定优势菌并保种，-20℃冰箱保存待用。质控菌株：表皮葡萄球菌生物膜表达阴性株ATCC12228(青岛普华科仪商贸有限公司)。

1.2 主要试剂及设备

主要试剂：刚果红(Congo Red)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、结晶紫、碘化丙啶(PI)溶液。设备：各规格移液器：德国Eppendorf公司、隔水式电热恒温培养箱:上海跃进医用光学器械厂、电子秤：日本SHIMADZU公司、酶标仪：美国Thermo公司、超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司、96孔聚苯乙烯微量培养板：美国COSTAR®公司、细菌浊度仪：北京天安联合科技有限公司、激光共聚焦荧光显微镜：尼康映像仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 表皮葡萄球菌产膜能力定性试验[9]

施工组织设计是招标人考核投标人施工技术水平和管理能力的依据，也是投标人合理报价和中标后组织施工管理的基础。当前，招标人越来越重视施工组织设计的评审，以选择报价合理、技术水平高、施工方法先进的施工队伍。因此，投标企业要根据招标文件的要求及现场特点，结合企业自身的技术水平、管理水平、施工经验、技术装备等实际情况，认真优化施工组织设计，尤其施工方案的优化比选，如土方开挖是采用人工开挖还是采用机械开挖，运输工具采用机动翻斗车还是采用自卸汽车。企业应制定相应激励制度，鼓励技术人员不断创新，优化施工方案和施工部署，通过技术创新、管理创新，降低成本。

(1)试验菌株的复温、复苏及复壮：从-20℃冰箱中取出试验菌株室温复温，在超净工作台中用接种环将其接种于TSA平板上，置37℃恒温培养箱中24h后取出(复苏)。再次用无菌接种环挑取一个菌落接种于另一个TSA平板，置恒温培养箱中37℃孵育24h后取出(复壮)。(2)刚果红平板定性PIA+菌株：从复壮后的平板上挑取一个菌落接种于刚果红平板上，置37℃恒温培养箱中孵育24h后取出，室温放置72h后，肉眼观察结果。若菌落黑色、干燥、聚集，并出现结晶为PIA+菌株；菌落红色、光滑、无聚集则为PIA-菌株。(3)光镜下检验表皮葡萄球菌：从复壮后的平板上挑取一个菌落至载玻片，经革兰氏染色，光学显微镜下观察。(4)标记PIA+菌株。(5)每组试验独立重复三次。

1.3.2 表皮葡萄球菌产膜能力定量试验[9]

(1)将含有接种表皮葡萄球菌的TSB放入恒温摇晃培养箱中37℃增菌18h，使用细菌浊度仪用TSB调整细菌浊度至0.5麦氏单位(McFarland MCF)。(2)取96孔聚苯乙烯微量培养板，每孔加入100μl培养液，接种10μl菌液，每种菌株做9个孔的重复。每板设ATCC12228为阴性对照，空白对照及培养基对照，均做9复孔。(3)将接种好的96孔板在37℃恒温培养箱中培养24h(4)吸出后培养液，加入PBS缓冲液冲洗板孔3次。(5)加入甲醇固定15min，吸出培养孔中的甲醇，风干。(6)每孔加入结晶紫溶液，室温下染色5min。(7)吸出结晶紫染色液，流水冲净多余的染料。(8)培养板倒置除去残余水，37℃烘箱中烘干。(9)加入冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min。(10)用酶标仪在590nm波长处分别测定其A值。(11)产膜能力结果判定：每株试验菌的 A值为其A590平均值减去空白对照孔A590平均值。标准菌株的A值测量同上操作，以标准菌株A值加上3倍标准差为界定值Ac，待测菌株A值大于界定值Ac即可判断为其具有产膜能力。具体标准如下：

①强生物被膜形成株(A>2Ac)；

②弱生物被膜形成株(Ac

③无生物被膜形成株(A≤Ac)。

1.3.3 激光共聚焦观察体外培养细菌生物膜

取灭菌后带盖玻片的培养皿，分2组，加入15ml待试验的表皮葡萄球菌PIA+株菌液0.5MCF，置37℃恒温培养箱中分别培养0.5d、1d、3d、7d，每天更换一次菌液。第1组用于观察不同时间段体外培养的表皮葡萄球菌生物膜形态结构的变化。

2 结果

2.1 分离需氧优势菌种

临床共收集实验组20例鼻分泌物、19例鼻分泌物分别经分离培养后需氧优势菌种，总结见下表：

细菌种类试验组(共20例)对照组(共19例)表皮葡萄球菌108金黄色葡萄球菌4—金黄色葡萄球菌+表皮葡萄球菌—1嗜麦芽窄食单胞菌2—人葡萄球菌12耳葡萄球菌11类白喉棒状杆菌22似肠膜明串珠菌—3沃氏葡萄球菌—1玫瑰色克库菌—1

2.2 表皮葡萄球菌产膜能力定性试验

2.2.1 观察结果

试验菌株：

18株表皮葡萄球菌临床株接种于刚果红平板，37℃恒温孵育24h后，肉眼观察可见大部分菌落呈鲜红色、暗红色、深酒红色、部分呈暗褐色，少数单个菌落呈黑色，菌落表面光滑、湿润。菌落形态与在TSA培养基上大小基本一致，菌落周围培养基未见明显褪色。室温状态下放置24h后可见鲜红色菌落减少，深酒红色居多，一部分菌落表现为中央黑色或暗褐色，边缘鲜红整齐，部分呈暗褐色甚至黑色。深色菌落表面相对浅色菌落干燥，边缘不光滑，未见明显结晶样物。菌落聚集，周围培养基明显褪色。(附图1)

附图1

质控菌株ATCC12228接种于刚果红平板，37℃恒温孵育24h后，肉眼观察可见菌落呈鲜红色，菌落表面光滑、湿润。菌落形态与在TSA培养基上大小基本一致，菌落周围培养基无明显褪色。室温状态下放置24h后见大部分菌落仍呈鲜红色，一部分菌落表现为中央颜色变深，边缘鲜红整齐。菌落湿润，边缘光滑。菌落无聚集，周围培养基无明显褪色。(附图2)

2.2.2 统计结果

18株表皮葡萄球菌临床株中，具有产膜能力的有11株，其中试验组9株，对照组2株。

表2.2 试验组与对照组鼻-鼻窦表皮葡萄球菌PIA表达结果

附图2

附图3

2.3 表皮葡萄球菌产膜能力定量实验

试验组9株表皮葡萄球菌有产膜能力，其中强产膜株1株，弱产膜株8株。对照组有2株具有产膜能力，且为弱产膜株。

表3.1 表皮葡萄球菌产膜能力定量测定

3 讨论

CRS患者中的菌群分布特点：本研究中CRS患者、健康者窦口鼻道复合体处分离最多的需氧菌是表皮葡萄球菌，所占菌群比例分别是50%、42.11%，由此可见表皮葡萄球菌为无论在CRS组中还是对照组中均为优势菌种，与与文献报道结果相符。[7,10-11]产膜率及产膜强弱：本试验中PIA+菌株占表皮葡萄球菌总菌株的61.1%，在CRS患者和健康人中均有发现具有产膜能力的菌株，实验组与对照组的成膜率分别为90%、25%，对CRS组、对照组进行产膜表达率进行四格表确切概率法检验χ2=7.901、P=0.005(P<0.01)，说明试验组的产膜率明显高于对照组。对CRS组、对照组成膜强弱进行秩和检验U=2.731、P=0.016(P<0.05)具有统计学意义，证明试验组产膜强度大于对照组。在产膜能力结果判读上，刚果红定性试验和结晶紫染色法试验结果无明显差异性。由此可见细菌生物膜在CRS患者中有一定存在比例，并据此结果可以推断细菌生物膜是导致慢性鼻窦炎耐药及迁延不愈的一个重要因素。

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The bactcriac biofilm observation of clinical nasal sinuses staphy lococcus epidermis strains in ritro culture

XIE Hui,YU Fei,LI Lin-long,DOU Dou,WEN Dong-ping,CAO Liu

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu,Sichuan,610075)

Objective Calculating the proportion of superiority strains for staphylococcus epidermis cases which are respectively in patients with chronic nasal sinusitis (CRS) ,and healthy people.compared the two groups after staphylococcus epidermis aureus in vitro bacterial biofilm production rate and production membrane strength.Comparing the two staphylococcus epidermis groups whose rate of bacterial biofilm production and the strength of biofilm after cultured in vitro.Methods Packeting nasal secretions of chronic nasal sinusitis patients and the healthy people.Identifying superiority strains in secretions.The advantages of strains for staphylococcus epidermis strains will be separated,storaged respectively；By Congo red plate filtering biofilm positive strains and by crystal violet staining semi-quantitative detecting biofilm production strength.Results There ere 39 cases of nasal secretions,among them including 20 CRS，19 healthy people; Congo red plate method measure biofilm positive strains 11 strains,including CRS9 strains,healthy people 2 strains；Compared with Congo red plate the results of crystal violet staining semi-quantitative are the same.Conclusion the staphylococcus epidermis account for aerobic bacteria the largest proportion in CRS.The proportion of CRS staphylococcus epidermis clinical strains cultured in vitro are obviously higher than healthy people.The ability of biofilm production of CRS patients staphylococcus epidermidis clinical strains which are clutured in vitro is stronger than heslthy people.

Staphylococcus epidermidis; Invitro culture; Biofilm; Chronic nasal sinusitis

基金来源：国家自然基金项目(项目编号：81403440)

610075,四川成都，成都中医药大学

谢慧,E-mail：wangxie-ctu@163.com

10.3969/j.issn.1674-9006.2017.01.005

R765.4