鸡白痢沙门氏菌分离株invA基因的克隆与序列分析

刘志科，张秋雨，杨宁宁，徐明国，陈创夫

（1石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2河南科技学院动物科技学院，河南 新乡 453003）

0 引言

鸡白痢沙门氏菌是一种革兰氏阴性杆菌，是由沙门氏菌属中的多种血清型的沙门氏菌引起禽类疾病的总称[1]，多侵害20日龄以内的雏鸡和雏火鸡，不形成芽孢，自然宿主为鸡，不仅可以经蛋垂直传播，也可以通过水平传播，发病率和死亡率较高，临床上以病鸡拉白色糊状稀粪为主要特征，是养鸡业中危害最严重的一种致病菌。近年来，鸡由于感染鸡白痢沙门氏菌引起的死亡不计其数，给养殖业造成了巨大的社会和经济问题，严重威胁着我国养鸡业和公共卫生问题。据报道，在美国每年因感染沙门氏菌相关的疾病超过40 000例，死亡人数至少在400例以上，其发病率呈直线上升趋势，备受各国关注[2]。而我国的细菌性食物中毒事件中，有75%左右都是由沙门氏菌感染引进的，该菌是一种重要的食源性致病菌。1885年美国兽医师Daniel Elmer Salmon首次从病猪中分离出沙门氏菌[3]，随后在世界各地都陆续报道了该病的发生；而鸡白痢沙门氏菌最早是在1899年，被Retgter发现引起禽白痢的鸡白痢沙门氏菌，对该病的认识和深入研究发挥了重要的关键作用；中国是在1974年前后发现了沙门氏菌[4]。查华等[5]在2010—2012年对我国华东地区主要养鸡场的鸡白痢沙门氏菌病进行了调查，结果发现该地区鸡白痢沙门氏菌感染相当严重，其D群为优势血清群，血清型差异变化大，并呈明显的上升趋势。因此，如何更有效的预防鸡白痢沙门氏菌病的发生和了解该病的致病机理显得尤为重要。

鸡白痢沙门氏菌致病菌株侵袭动物体内的上皮细胞以后，可以通过细胞层到达下层组织，一部分被机体吞噬细胞所杀灭，另一部分存活的沙门氏菌仍在组织器官内进行生长繁殖，这些相关的因素构成了沙门氏菌的主要侵袭力[6]。该菌的致病力由沙门氏菌的毒力岛、黏附素、脂质A和毒力因子（invA，invB，invC，invD）等所决定的，而这些毒力因子常常存在于染色体和质粒上，在沙门氏菌入侵的过程中发挥了关键作用，它们编码的产物对于病原体在机体内的定居或增值提供了有利的条件，从而可以引起机体损伤[7]。invA基因又称侵袭蛋白，为高度保守的细胞膜整合蛋白，是沙门氏菌侵入动物体内的主要毒力因子，可以作为诊断鸡白痢沙门氏菌的一个潜在的标记物[8]；而invA基因包含了独特的沙门氏菌保守序列，所产生的靶向区域可针对性的用于诊断鸡白痢沙门氏菌，具有重要的检测意义。多名研究学者已经证实invA基因是一个高度保守的靶基因，存在于所有的沙门氏菌血清型当中，被视为检测鸡白痢沙门氏菌病的一个重要的目标基因[9-10]。鉴于此，本研究在前期对乌鲁木齐周边种鸡场鸡白痢沙门氏菌病的流行状况进行调查分析的基础上对该地区主要流行株的invA基因，通过PCR方法进行克隆测序和生物信息学分析，为该地区鸡白痢沙门氏菌新疆株的遗传特征以及后续的invA基因的功能研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株

鸡白痢沙门氏菌由本课题组与2017年6月采自新疆乌鲁木齐周边大型种鸡场具有典型症状的病鸡肠道内容物和血液，通过平板凝集试验和免疫胶体金试纸条确诊为鸡白痢沙门氏菌病后，从肠道内容物中分离出该菌，-20℃保存。

1.1.2 主要试剂

T-vector pMD19、2×ES Taq MasterMix、 细菌基因组DNA提取试剂盒、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、EcoR V、XhoⅠ限制性内切酶和小量质粒提取试剂盒等，均购于北京全式金生物技术有限公司；DH5α感受态细胞为石河子大学人畜共患病试验室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank数据库中已报道的鸡白痢沙门氏菌保守的invA基因序列（NC_003 198.1），利用Oligo 6.0软件在其保守区设计一对特异性引物，其invAF：5'-CGGAATTCGTGCTGCTTTCTCTACT TAAC-3'；invAR：5'-CGCTCGAGCTCATTAATCAA CAATACGA-3'，并在其上游和下游引物的5'端分别插入酶切位点EcoR V和XhoⅠ，其预期目的片段扩增大小为1 251 bp，引物由北京华大基因科技有限公司合成。

1.2.2 细菌基因组的提取

取甘油管里保存的鸡白痢沙门氏菌20μL，接种到20 mL的LB液体培养基里37℃摇床里过夜进行扩繁。之后，按照细菌基因组DNA提取试剂盒的说明要求提取鸡白痢沙门氏菌的基因组。最后，用核酸蛋白仪测定其浓度，-20℃保存备用。

1.2.3 invA基因的扩增与克隆

以鸡白痢沙门氏菌的基因组为模板，PCR反应体系为：DNA模板2μL，2×ES Taq MasterMix 10μL，引物 invAF和invAR各0.4μL，dd H2O补足至20μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，57℃退火40 s，72℃延伸70 s，30个循环；72℃终延伸10 min。取6μL的 PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。将目的片段切下按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书的要求进行胶回收，其回收产物与T-vector pMD19在16℃的水浴下过夜连接，其连接物转化到大肠杆菌DH5α感受态中进行克隆，用蓝白板进行筛选，将PCR鉴定为阳性的克隆菌，并提取质粒，用EcoR V和XhoⅠ进行双酶切鉴定；将酶切鉴定的疑似阳性质粒送到生物工程（上海）科技股份有限公司进行测序分析。

1.2.4 invA基因的生物信息学分析

利用MegAlig 7.0软件将鸡白痢沙门氏菌阳性质粒的测序结果与标准株invA基因序列进行BLAST比对；并与GenBank中已公布的主要代表性的12株invA基因的核苷酸序列及其所对应编码的氨基酸序列进行同源性分析；利用Mega 4.0软件在此基础上对invA基因的核苷酸序列构建遗传进化树，进而得到该物种间invA基因的起源及系统进化关系。采用蛋白质二级结构在线预测服务器SOPMA上预测invA蛋白质的二级结构；利用SWISS-MODEL同源模建invA蛋白的三级结构。

2 实验结果

2.1 invA基因的PCR扩增结果

利用设计的一对特异性引物invAF和invAR，以分离的鸡白痢沙门氏菌的invA的基因组为模板，进行PCR扩增，其PCR产物进行电泳得到大小约1 251 bp的目的片段（图1），与预期的理论结果相符合。

图1 新疆株invA基因的PCR产物扩增结果Fig1 The PCR amplified results of invA gene in Xin jiang strain

2.2 invA基因重组质粒的双酶切鉴定

将胶回收产物与T-vector pMD19过夜连接后，获得的重组质粒pMD19-invA为模板进行PCR扩增，电泳检测在1 251 bp大小处出现一条特异性的目的条带；重组质粒PMD19-T-invA经EcoR V和XhoⅠ双酶切后，分别在大约2 692 bp和1 251 bp处产生两个条带（图2），与预期理论值大小一致。测序结果与GenBank数据库中的参考的基因序列（NC_003 198.1）比对相似性为99.8%。结果表明invA重组质粒pMD19-invA构建成功，获得了invA基因的阳性克隆菌。

图2 重组质粒双酶切鉴定电泳结果Fig2 Double enzyme digestion of electrophoresis re sults of recombinant plasmid

2.3 分离株invA基因的同源性比对及系统进化树分析

将新疆株的invA基因的阳性重组质粒进行测序后，经SeqMan软件进行拼接后得到invA基因的全核苷酸序列。同源性比对结果表明，与GenBank中标准（NC_003 198.1）的鸡白痢沙门氏菌invA基因序列的同源性达到99.8%，其氨基酸序列的相似性在99.7%；分离株的invA序列与食酸代尔夫特菌（NC_005 088.1）、铜绿假单胞菌（NC_007 100.1）、色素杆菌（NZ_LCWP01 000 015.1）、大肠杆菌（NC_011 751.1）、摩氏摩根菌（NC_020 418.1）、梨火疫病菌（NC_013 961.1）、耶尔森氏菌（NZ_CP011 078.1）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（NC_008 800.1）、马红球菌（NC_004 854.1）和野生烟草（NW_017 671 775.1）的核苷酸同源性序列分别为24.9%、26.3%、54.0%、51.1%、43.1%、40.8%、27.8%、25.3%、25.4%和28.0%（图3），其与各自所编码的氨基酸序列的同源性为22.0%—76.8%（图4）。

图3 鸡白痢沙门氏菌分离株i nvA基因与其他物种间的invA基因的核苷酸序列的同源性比较Fig3 The nucleotide homology analysis of Salmonella pullorum isolates of invA gene of strain with other species

图4 鸡白痢沙门氏菌分离株i nvA基因与其他物种间的invA基因的氨基酸序列的同源性比较Fig4 The amino acids homology analysis of Salmonella pullorum isolates of invA gene of strain other species

用MegAlig 7.0对invA基因的核苷酸序列构建系统进化树，其分离株与国内外主要的11个物种的参考invA毒株进行基因的分类单元间的分子进化遗传关系进行分析，结果显示（图5），分离株的invA基因与耶尔森氏菌参考株在同一个大的分支上，同源性比较高，亲缘关系十分接近，相互间差异较小，与标准株的invA基因的遗传距离最近，为平行进化和同源基因。但需要指出的是，其分离株与野生烟草、食酸代尔夫特菌、马红球菌和铜绿假单胞菌的遗传关系最远，为独立的一个分支结构，在其进化的过程中可能发生了一定的变异。

图5 鸡白痢沙门氏菌分离株与其他物种间invA基因序列的遗传进化树分析Fig5 The phylogenetic tree analysis of Salmonella pullorum isolates of invA gene of strain other species

图6 invA蛋白新疆分离株的二级结构预测结果Fig6 The secondary structure prediction results of invA protein of isolate strain in Xinjiang

2.4 invA蛋白的二级结构和三级结构分析

利用SOPMA在线软件服务器Prodiction分析结果（图6），发现invA分子的二级结构元件组分中，α-螺旋占43.18%；β-折叠占25.35%；β-转角占11.42%；无规则卷曲所占比例为20.06%，表明该蛋白属于α型蛋白。利用SWISS-MODEL在线软件服务器对新疆分离株鸡白痢沙门氏菌invA蛋白与模板信息比对发现（图7），该目的基因所编码蛋白的三级结构中，主要由α-螺旋和β-折叠组成，与二级结构预测信息的结果相符合，可信度较高。

图7 invA蛋白新疆分离株的三维结构预测结果Fig7 The tertiary structure prediction results of invA protein of isolate strain in Xinjiang

3 讨论

由于新疆的饮食习惯和民族风情的特殊性，人们对鸡肉的需求量呈直线上升趋势，石河子、乌苏和乌鲁木齐等3个县市又称为新疆养鸡业的“金山角”地区，而鸡白痢沙门氏菌病给该地区的养禽业和食品行业造成了巨大的经济损失。目前，对于鸡白痢沙门氏菌病的流行病学知识的研究报道比较少。因此，本研究对于本地区鸡白痢沙门氏菌病的防控和净化具有重要的公共卫生参考价值。在西方国家，鸡白痢沙门氏菌病已基本消灭和控制，由于我国的养鸡业起步较晚，技术相对落后，该病在我国的一些地区的爆发时有发生，其主要原因是饲养环境差、鸡群密度大以及饲养人员的防控意识不强，或者缺乏专业的理论知识[11]。

invA基因具有检测和预防鸡白痢沙门氏菌感染的功能，是鸡白痢沙门菌重要的毒力因子，决定细菌能否进入动物上皮细胞的关键因子，与细菌的致病性密切相关[12-13]。唐梦君等[14]人利用invA基因的保守区域，建立了一种用于检测鸡蛋中沙门氏菌的LAMP方法，其灵敏性为1.04×102cfu/mL，该方法的的检测结果与传统方法的检测结果一致；刘志科等[15]人利用沙门氏菌的靶基因建立了鸡白痢沙门菌套式PCR方法，其灵敏度为102cfu/μL，与传统的金标准方法的符合率为95%；周爱萍等[16]通过原核表达获得了invA重组蛋白，并通过Werter blotting和间接ELISA方法，验证了该蛋白具有较好的免疫原性，为该蛋白制备免疫血清用于临床应用奠定了基础。本研究采用常规PCR方法，以分离株的鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，成功扩增出invA基因新疆株，并利用生物信息学知识进行了分析，为研究鸡白痢沙门氏菌invA基因缺失苗和invA蛋白抗原表位的研究提供了一定的理论基础。

本试验通过克隆获得了鸡白痢沙门氏菌新疆株的invA基因，其大小为1 251 bp，共编码417个氨基酸，利用MegAlig 7.0对分离株的invA基因序列与GenBank公布的鸡白痢沙门氏菌标准株的核苷酸同源性达到了99.8%，与其他物种的基因序列同源性最高为54.0%；而与鸡白痢沙门氏菌标准株invA基因所编码的氨基酸同源性达到了99.7%，与不同物种的invA基因所对应的氨基酸的同源性为22.0%—70.7%，说明该基因比较保守。通过绘制不同物种的系统进化树可知，该分离株与鸡白痢沙门氏菌标准株的遗传进化关系最近，色素杆菌次之，与野生野草的亲缘关系最远，也进一步说明该基因在进化上相对保守；对invA蛋白的二级结构预测发现，该结构中α-螺旋含量占43.18%；β-折叠占25.35%；β-转角占11.42%；无规则卷曲占20.06%；由于β-折叠＞5%，所以该蛋白为非分泌蛋白，性质比较稳定，这也为B细胞优势抗原表位的筛选起到了铺垫作用；invA蛋白属于α型蛋白，在蛋白结构的稳定中可能起到主要的作用，亚细胞定位预测该蛋白在细胞核和线粒体中的可能性较大；利用SWISS-MODEL在线软件服务器对新疆分离株鸡白痢沙门氏菌invA蛋白与模板信息进行比对发现，invA蛋白的三级结构主要由α-螺旋和延伸链组成，与二级结构预测结果一致。

本实验利用invA基因作为诊断标志物，对新疆乌鲁木齐地区周边几个大型种鸡场的鸡白痢沙门氏菌病的流行情况进行调查分析，结果表明，该地区鸡白痢沙门氏菌病的发生率为9.2%。通过调查发现，虽然该病的血清学种类比较繁多，但本地区的主要流行株为D1型，这可能是鸡白痢沙门氏菌病的某些血清型当时的抗体水平含量比较低，未能检测到有效的抗体水平所造成的。

4 结论

本研究通过PCR方法获得了新疆株invA基因，大小为1 251 bp，与鸡白痢沙门氏菌标准株invA基因核苷酸的同源性为99.8%，与其他物种的核苷酸同源性为24.9%—54.0%；与标准株的invA氨基酸序列同源性为99.7%，与其它物种的氨基酸序列的相似性为22.0%—70.7%；进而证实了该基因比较保守。invA蛋白的二级和三级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主，且该蛋白为非分泌蛋白。本研究为新疆部分地区鸡白痢沙门氏菌invA基因的克隆、生物学功能研究以及鸡白痢沙门氏菌病的防控奠定了基础，同时为以invA蛋白为诊断抗原的快速检测试纸条的开发提供了新的素材。

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