丙戊酸对HL—60/HT细胞P27Kip1、P170表达水平的影响

胡建锋+尹松梅+谢双锋

[摘要] 目的 了解丙戊酸对HL-60/HT细胞P27Kip1的影响。方法 建立白血病耐药细胞株HL-60/HT，MTT法检查丙戊酸作用前后细胞增殖情况及对Ara-c耐药性的改变，流式细胞仪检测HL-60、HL-60/HT细胞P27Kip1、P170的表达。结果VPA能增加HL-60、HL-60/HT细胞P27Kip1的表达水平（P<0.05），而不影响P170的表达（P>0.05）；Ara-c不能影响HL-60、HL-60/HT细胞的P27Kip1、P170的表达（P>0.05）；VPA与Ara-C联用能增加HL-60、HL-60/HT细胞P27Kip1的表达水平（P<0.05），不影响P170的表达（P>0.05）。结论 HL-60/HT细胞P27Kip1低于HL-60，丙戊酸能增加HL-60/HT细胞P27Kip1的表达。

[关键词] 白血病；丙戊酸；HL-60/HT细胞；耐药性

[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）06-151-04

[Abstract] Objective To understand the impact of valproic acid to expression level of P27Kip1 and P170 of HL-60/HT cells. Methods Leukemia resistant cell line HL-60/HT was established. MIT method was used to deteccell proliferation before and after valproic acid and its changes to drug resistance of Ara-c. Flow cytometry was used to detect the expression of P27Kip1 and P170 of HL-60 and HL-60/HT cells. Results VPA could increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Ara-c could not affect the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. VPA combined with Ara-C can increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Conclusion P27Kip1 of HL-60/HT cells is lower than HL-60 cells. Valproic acid can the expression of P27Kip1 of HL-60/HT cells.

[Key words] Leukemia； Valproic aci； HL-60/HT cell； Drug resistance

近年白血病发病率有所上升，其治疗方法多采用联合化疗[1]，60%～70%患者经治疗后症状缓解后复发。白血病细胞固有或获得的多药耐药性是在治疗过程中出现失败的重要原因[2-5]。多耐药基因mdr-1表达产物P170起着重要作用。P27Kip1能调控mdr-1基因的转录，减少P170表达，逆转多耐药细胞的耐药性[6-7]。丙戊酸（VPA）是常用的抗癫痫药物，治疗癫痫具有很好的效果，是一种组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂，通过调节染色质构象和转录活性，进而影响基因表的的活性药物。近来研究发现丙戊酸能降低HL-60/HT细胞对Ara-c的耐药性[8]，而丙戊酸是否通过P27Kip1、P170途径起作用呢？本研究进一步分析了丙戊酸对HL-60、HL-60/HT细胞P27Kip1、P170表达的影响。

1 材料与试剂

本研究所需试剂与材料有RPMI1640培养基、二甲基亚砜、四氮唑蓝、VPA、淋巴细胞分离液、HEPES、羟乙基哌嗪乙磺酸、VCR、HT、Ara-C、HL-60细胞，均由正规公司及企业购买。

2 方法

2.1 正常人单个核细胞的分离

选择10名健康的体检者，取空腹血置肝素抗凝管，加入D-HankS液平铺于液面上，混匀后离心约20min，离心后试管内分为3层，吸取单个核细胞层，置另一试管中，加入5倍以上容量的D-HankS液，洗涤细胞，最后一次离心后去上清液，然后加入PBS缓冲液，重悬细胞后留用。

2.2 细胞培养及建立耐药株

将HL-60细胞接种于RPMI-1640完全培养基上，37℃、5%CO2培养增菌，换液1次/2d，4～5d传代一次。

采用极限稀释法筛选耐药的细胞克隆。具体方法为：将对数期HL-60细胞培养于RPMI 1640培养基中，建立HL-60/HT耐药细胞株。HT浓度为0.005μg/mL，2d后换培养液，清洗，去除药物，继续培养2d。经3次初始浓度的培养后，药物浓度增为原来的2倍。5個月后测定HL-60/HT耐药细胞的半数抑制浓度（IC50），对多药耐药细胞进行确认。

2.3 药物对两种细胞的增殖抑制率

通过MTT法检测Ara-c抑制HL-60/HT、HL-60细胞的增殖情况。取重悬的细胞接种于96孔平板，每孔200μL，约20 000个细胞，5%CO2、37℃条件下孵育24h，然后加入Ara-C。两组均有无培养液和无药对照组。48h后每孔加入20μL浓度为5g/L MTT，继续孵育4h后除去培养液，每孔加150μL DMSO，置震荡仪上振荡10min，采用酶标仪，以无细胞组调零，测595nm和492nm处的吸光度。细胞生长抑制率=（无药对照组吸光度均值-实验组吸光度均值）/无药对照组吸光度均值×100%[9]。计算各种药物的IC50。

2.4 耐药的稳定性测定

用无药RPMI 1640培养基培养HL-60/HT子代细胞两个月，并检测对HT的IC50值，具体方法参照2.3，确定HL-60/HT细胞耐药稳定性。

2.5 流式细胞术测定P27Kip1、P170的表达

设HL-60和HL-60/HT细胞组，又各分正常人单个核细胞组、药物（Ara-c、VPA单独或联合）作用前和作用后。将重悬细胞的密度调整为l×l06/mL，取100μL破膜液A加入到50μL细胞悬液中，并放置于避光的温室内，用2mL PBS缓冲液以1000×g转速离心5min洗涤，弃上清，于细胞悬液中加入破膜液B 100μL和5μL抗P27Kip1也可以是P170抗体，PBS缓冲液洗涤。加入FITC标记二抗5μL，静置15min后离心洗涤。取1%浓度的多聚甲醛450μL，固定30min，然后用流式细胞仪进行检测。将P27Kip1或P170抗体换成PBS即可进行空白对照。

2.6 统计学分析

所有数据均用SPSS12.0统计软件处理，计量数据的描述用（）表示，采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 Ara-c对HL-60、HL-60/HT细胞的IC50

Ara-C对HL-60细胞的中位抑制浓度是0.20μg/mL，对HL-60/HT细胞的中位抑制浓度是0.73μg/mL，耐药倍数3.65倍。

3.2 HL-60细胞耐药稳定性检测

HL-60/HT耐药株传代后，用无药的RPMI 1640培养基培养其子代细胞，测定其对HT的IC50，结果无明显改变，细胞株的耐药性能稳定。

3.3 细胞表达P27Kip1、P170水平

正常细胞、HL-60细胞及HL-60/HT细胞中P27Kip1表达水平依次降低，两组间差异均有统计学意义（P<0.05）；HL-60/HT细胞的P170表达水平明显高于正常细胞及HL-60细胞，差异均有统计学意义（P<0.05）。

3.4 VPA与Ara-c对不同细胞P27Kip1、P170表达水平的影响

HL-60细胞予1mmol/L VPA、0.2μg/mL Ara-c，HL-60/HT细胞予1mmol/L VPA、0.7μg/mL Ara-c各培养48h，流式细胞仪测定P27Kip1、P170的表达水平。结果提示VPA能增加HL-60、HL-60/HT细胞P27Kip1的表达水平（P<0.05），但对P170表达水平无显著影响（P>0.05）；Ara-c对P27Kip1、P170的表达水平均无显著影响（P>0.05），见表1。

3.5 比较VPA与Ara-c联用对不同细胞的P27Kip1、P170表达水平影响

HL-60细胞用0.20μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培养48h，HL-60/HT细胞用0.70μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培养48h，流式细胞仪测定P27Kip1、P170的表达水平。结果显示VPA与Ara-C联用，能增加敏感HL-60细胞、耐药HL-60/HT细胞P27Kip1的表达水平（P<0.05），不影响P170的表达（P>0.05），见表2。进一步分析VPA、Ara-c在联用用药中各自对对HL-60、HL-60/HT细胞P27Kip1的影响，结果提示无论在HL-60细胞还是HL-60/HT细胞，Ara-C对P27Kip1的表达水平无影响（均有P>0.05），VPA单用或联用Ara-c均增加P27Kip1的表达水平（均P<0.05），见表3。

4 讨论

白血病是血液病中较为常见的疾病，主要是由于造血干细胞异常克隆性疾病，近年来，随着免疫学、细胞学、遗传学、分子生物学的进步与发展，加强了对白血病患者的诊断，对白血病的本质有了更加深刻的认识。白血病患者的白细胞形态学具有特异性，可以依靠白细胞的形态学直接诊断，非典型白血病发病原因多样，症状复杂，很难及时诊断。据相关文献报道，白血病的漏诊率为20%～36%，为此加强细胞学、免疫学、遗传学、分子生物学具有重要的诊断意义。

本研究进一步分析VPA与P27Kip1、P170的关系，了解VPA发挥作用的可能机制。研究发现，随着肿瘤恶性度增加，P27Kip1的表达逐渐减低[10-12]。本研究也发现在正常细胞、HL-60细胞、HL-60/HT细胞中，P27Kip1的表达逐渐减低，提示P27Kip1表达与细胞恶性程度、耐药情况呈负相关[13-14]，可以监测P27Kip1的表达，判断疾病恶性程度，了解耐药细胞的产生，预测疾病预后。结果提示VPA对HL-60，HL-60/HT细胞的P170表达无影响，与其他研究的实验结果一致[15]，可能和VPA与丁酸钠、TSA的具体作用机制不同有关。VPA不增加白血病细胞P170的表达，相比于丁酸钠、TSA更有希望成为应用于临床的化疗增敏剂。

耐药白血病HL-60/HT、HL-60、P170细胞P27Kip 1的表达敏感度存在差异，敏感性最强的为P170，HL-60敏感性最弱，丙戊酸鈉可影响P27Kip 1的表达，增加G1期细胞含量，发挥抗肿瘤活性；同时，VPA可增强HL-60/HT细胞对Ara-C的敏感性，减轻其耐药性，起到化疗增敏的作用。丙戊酸钠口服、携带方便，对正常细胞毒性低，具有抗肿瘤活性和增加化疗敏感性的作用，可作为治疗耐药白血病辅助药物。其作用机制尚不明确，有待进一步研究。

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（收稿日期：2017-01-02）