HPLC法测定复方克林霉素乳膏中盐酸克林霉素和甲硝唑的含量＊

高 媛，孙 旭，马晓昱，刘云云，张志国，陈 瑶

复方克林霉素乳膏是解放军第88医院研制，由盐酸克林霉素、甲硝唑、尿素、醋酸地塞米松等组成的复方制剂。盐酸克林霉素和甲硝唑分别具有较强的抗菌和抗炎作用，对厌氧菌、敏感的革兰阳性菌等有抑制作用；醋酸地塞米松为肾上腺皮质激素类药，有抗过敏、止痒等作用，联合使用对痤疮、脓疱疹、湿疹、各类皮炎及瘙痒性皮肤病有较好的治疗作用。为了进一步完善该品种的质量标准，配合医疗机构制剂标准提高，笔者对该制剂的质量标准进行修订，建立HPLC测定复方克林霉素乳膏中盐酸克林霉素和甲硝唑含量的方法［1］，结果准确，重现性好，能有效控制该制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器 METTLER AE240电子天平 （梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪 （安捷伦科技有限公司，VWD检测器，数据分析系统为安捷伦系统自带）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；101型电热鼓风干燥箱 （北京科伟永兴仪器有限公司）。

1.2 试药 乙腈为色谱纯；对照品盐酸克林霉素（批号130422-201306，中国食品药品检定所，纯度：84.9%）、甲硝唑（批号100191-200606，中国食品药品检定所，纯度：99.9%）；复方克林霉素乳膏（批号140812、140813、140815）。

2 方法与结果

2.1 盐酸克林霉素的含量测定［1-4］

2.1.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸二氢钾（取磷酸二氢钾3.4 g溶于400 ml水中，用8 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH 至 7.5）-乙腈（55∶45）为流动相；检测波长为210 nm；柱温为30℃；流速1.0 ml/min；理论板数按克林霉素峰计算不低于2500。阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图见图1～3。

图1 阴性对照品HPLC图

图2 盐酸克林霉素对照品HPLC图

图3 复方克林霉素乳膏样品HPLC图

2.1.2 对照品溶液的制备 取盐酸克林霉素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 ml含盐酸克林霉素1.803 mg的对照品溶液（对照品储备液），精密量取适量于容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，即得360.7μg/ml的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取复方克林霉素乳膏2 g，置50 ml量瓶中，加流动相适量于50℃水浴中使其溶解，放冷至室温，加流动相至刻度，冰浴冷却1 h后，滤过，取续滤液放至室温，即得。

2.1.4 阴性对照品溶液的制备 取缺盐酸克林霉素的样品，按“2.1.3”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.1.5 标准曲线的绘制 取“2.1.2”项下盐酸克林霉素对照品贮备液适量，以流动相为溶剂稀释，得系列标准溶液，含盐酸克林霉素为90.2、180.3、360.7、721.3、901.6 μg/ml，分别取 20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积值为纵坐标（Y），浓度（μg/ml）为横坐标（X）绘制标准曲线。计算得盐酸克林霉素回归方程：Y=5606.8X-16882，R2=0.9999，实验表明盐酸克林霉素在90.2～901.6μg/ml的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.1.6 精密度试验 分别精密吸取 “2.1.5”项下360.7μg/ml盐酸克林霉素对照品溶液 20μl，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD为0.53%。说明仪器的精密度良好。

2.1.7 重现性试验 取复方克林霉素乳膏 （批号140812），按“2.1.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，分别进样20μl，记录盐酸克林霉素峰面积值，计算 RSD（n=6）为0.31%，表明方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验 取复方克林霉素乳膏 （批号140812），按“2.1.3”项下方法配制供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12 h 进样 20μl，按“2.1.1”项下色谱条件，测定盐酸克林霉素的峰面积，计算RSD为0.26%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.1.9 加样回收率试验 取已知含量的复方克林霉素乳膏样品（批号140815）6份，在线性范周内分别加入一定量的盐酸克林霉素对照品溶液各6份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果详见表1。说明本方法回收率良好。

2.1.10 样品含量测定 按“2.1.1”项下色谱条件，分别精密吸取“2.1.2”、“2.1.3”项下溶液各 20μl，照2015 年版《中国药典》四部 0512［2］，进样 3 批复方克林霉素乳膏样品（批号 140812、140813、140815），每批样品测定3份，以外标法计算各个样品中盐酸克林霉素的含量，结果详见表2。

表1 复方克林霉素乳膏中盐酸克林霉素加样回收率试验测定结果（n=6）

表2 复方克林霉素乳膏中盐酸克林霉素含量测定结果（n=2）

2.2 甲硝唑的含量测定［1，2，5，6］

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（20∶80）为流动相；检测波长为320 nm；柱温为30℃；流速1.0 ml/min；理论板数按甲硝唑峰计算不低于2000。阴性对照、对照品以及供试品的HPLC色谱图见图4～6。

2.2.2 对照品溶液的制备 取甲硝唑对照品适量，精密称定，用流动相溶解制成每1 ml约含甲硝唑1.035 mg的溶液（对照品储备液）；精密量取对照品储备液适量于容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，滤过，即得51.7μg/ml的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取复方克林霉素乳膏0.5 g，置100 ml量瓶中，加流动相适量，50℃超声提取20 min，放冷，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

2.2.4 阴性对照品溶液的制备 取缺甲硝唑的样品，按“2.2.3”项下方法制备成阴性对照品溶液。

2.2.5 标准曲线的绘制 取“2.2.2”项下甲硝唑对照品储备液适量，以流动相为溶剂稀释，得系列标准溶液， 含甲硝唑为 12.9、25.9、51.7、103.5、207.0、414.0μg/ml，分别取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。 以峰面积值为纵坐标（Y），浓度（μg/ml）为横坐标 （X）绘制标准曲线。计算得回归方程，Y=61.761X+89.518，R2=0.9999。实验表明甲硝唑在12.9～414.0μg/ml的范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.2.6 精密度试验 精密吸取“2.2.5”项下51.7μg/ml甲硝唑对照品溶液 20μl，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD为0.01%。说明仪器的精密度良好。

2.2.7 重现性试验 取复方克林霉素乳膏 （批号140812），按“2.2.3”项下方法分别制备6份供试品溶液，分别进样20μl，记录甲硝唑峰面积值，计算RSD（n=6）为0.06%，表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取复方克林霉素乳膏 （批号140812），按“2.2.3”项下方法配制供试品溶液，分别于 0，2，4，8，12 h 进样 20 μl，按“2.2.1”项下色谱条件，测定甲硝唑的峰面积，计算RSD为0.20%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的复方克林霉素乳膏样品（批号140815）6份，在线性范周内分别加入一定量的甲硝唑对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果详见表3。说明本方法回收率良好。

2.2.10 样品含量测定 按“2.2.1”项下色谱条件，分别精密吸取“2.2.2”、“2.2.3”项下溶液各 20 μl，照2015 年版《中国药典》四部 0512［2］，进样 3 批复方克林霉素乳膏样品（批号 140812、140813、140815），每批样品测定3份，以外标法计算各个样品中甲硝唑的含量，结果详见表4。

图4 阴性对照品HPLC图

图5 甲硝唑对照品HPLC图

图6 复方克林霉素乳膏样品HPLC图

表3 复方克林霉素乳膏中甲硝唑加样回收率试验测定结果（n=6）

表4 复方克林霉素乳膏中甲硝唑含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 波长的选择 盐酸克林霉素在190～400 nm范围内没有最大吸收，仅有末端吸收，且文献报道［3，4］其在210 nm处的吸光度值为214 nm的2倍，因此选择检测波长为210 nm。甲硝唑在320 nm处有最大吸收，因此该文并未同时测定两者的含量，而是采用不同的波长分别对复方克林霉素乳膏中的盐酸克林霉素和甲硝唑进行测定。

3.2 流动相的选择 该复方制剂中盐酸克林霉素和甲硝唑分别参照 《中国药典》2015年版二部检测方法选择流动相，各杂质峰与主峰的分离度＞2.0，理论板数符合要求，符合HPLC法的要求。

综上所述，本实验建立了HPLC法测定复方克林霉素乳膏中盐酸克林霉素和甲硝唑的含量测定方法，具有灵敏度高、回收率良好，准确可靠的优点，可作为复方克林霉素乳膏的质量控制方法。

参考文献

［1］国家药典委员会编.中华人民共和国药典2015年版：二部［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：212-213，973-974.

［2］国家药典委员会编.中华人民共和国药典2015年版：四部［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：59-61.

［3］张带荣.高效液相色谱法测定盐酸克林霉素注射液含量［J］.中国医院药学杂志，2010，30（13）：1165-1167.

［4］黎渊弘，蒋 英，黎肇炎.消痘宁乳膏的制备及质量控制［J］.中国药房，2009，20（34）：2686-2688.

［5］张芦燕，王 坤，贺 凯，等.甲硝唑口颊片中甲硝唑含量测定及其方法学研究［J］. 宁夏医学杂志，2012，34（5）：453-454.

［6］陈 娟，徐 剑，张永萍.HPLC测定复方足癣乳膏中甲硝唑含量［J］. 贵阳中医学院学报，2016，38（2）：29-31.