熊果酸对荷肺癌裸小鼠移植瘤生长抑制及促凋亡作用研究

陈奎利，毛哲哲，胡彦峰，王慧玲，程 忠

河北省邯郸市中心医院(邯郸 056001)

熊果酸对荷肺癌裸小鼠移植瘤生长抑制及促凋亡作用研究

陈奎利，毛哲哲，胡彦峰，王慧玲，程 忠

河北省邯郸市中心医院(邯郸 056001)

目的： 研究熊果酸(Ursolic acid, UA)对荷肺癌裸小鼠移植瘤生长的影响并探讨其机制。方法：通过右侧腹股沟区皮下接种人非小细胞肺癌A549细胞的方法建立荷肺癌裸小鼠模型，分别腹腔注射给予不同剂量UA(5、10、20 mg/(kg·d))和顺铂(2 mg/(kg·d))进行干预治疗，疗程14d。观察裸小鼠生存状态和肿瘤特征；称量瘤重并计算抑瘤率；HE染色法观察肿瘤组织形态结构改变，TUNEL染色法观察肿瘤组织细胞凋亡状况，IHC法检测肿瘤组织中Caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表达并进行半定量分析。结果：与模型组比较发现：经UA治疗14 d能够明显改善荷肺癌裸小鼠饮食状况和精神状态，瘤体减小、活动度和硬度降低；较模型组，UA治疗组移植瘤组织呈现细胞皱缩、片状坏死等病变，凋亡细胞数量显著增多，瘤体重量显著减轻、抑瘤率显著升高；移植瘤组织中Caspase-3蛋白和Bax蛋白表达显著升高、bcl-2蛋白表达显著降低，Bax/bcl-2比值显著升高；UA上述作用均具有一定的剂量依赖性。结论:UA具有抑制荷肺癌裸小鼠移植瘤生长的作用，作用机制可能与UA调节凋亡相关蛋白(Caspase-3、Bax、bcl-2)表达而促进肿瘤细胞凋亡有关。

熊果酸(Ursolic acid, UA)又名乌索酸，是一种具有抗氧化、抗炎等多种药理学作用的五环三萜类化合物[1-2]，近年研究发现UA对肝癌等细胞生长均具有一定的治疗作用[3]，但UA对肺癌是否具有治疗作用尚未见文献报道。本实验通过制备荷肺癌裸小鼠模型并给予UA进行治疗，探讨UA对荷肺癌裸小鼠移植瘤生长的影响及其机制。

材料与方法

1 动物与细胞 Balb/C裸小鼠(雄性，鼠龄4～6周龄，体质量18～22 g)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0005；人非小细胞肺癌A549细胞株购自中科院上海细胞库。

2 试验药物与试剂 熊果酸购自陕西慧科植物开发有限公司(纯度≥98%)；注射用顺铂购自齐鲁制药(海南)有限公司；胰蛋白酶、MTT购自美国Sigma公司；TUNEL试剂盒购自南京建成生物研究所；Caspase-3、Bax、bcl-2单抗和SP免疫组化试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。

3 荷肺癌裸小鼠模型的制备、分组与给药 体外培养并取对数生长期人非小细胞肺癌A549细胞，用无菌PBS溶液制备浓度为5×107/ml细胞悬液，于右侧腹股沟区皮下注射接种(0.2 ml)A549细胞悬液建立荷肺癌裸小鼠模型，7 d后接种部位出现直径8～10 mm皮下结节即可认定为造模成功。取90只模型裸小鼠随机分为模型组、UA(5、10、20 mg/(kg·d))组和顺铂(2 mg/(kg·d))组，各组均16只，腹腔注射给药，疗程14 d。

4 裸小鼠生存状态、肿瘤特征的观察及瘤体重量、抑瘤率的测定 治疗完成后，分别观察各组裸小鼠生存状态(饮食状况、精神状态等)和瘤体特征(瘤体大小、活动度、硬度等)；采用颈椎脱臼方法处死动物、剥取肿瘤组织并称重，计算抑瘤率：抑瘤率(%)=(模型组瘤重-治疗组瘤重)/模型组瘤重×100%。

5 肿瘤组织形态结构改变和细胞凋亡状况观察 将肿瘤组织置于4%多聚甲醛溶液中固定72h，然后依次进行石蜡包埋、切片、脱蜡水化、常规HE染色和复染，通过显微镜观察肿瘤组织形态结构改变。石蜡切片经脱蜡水化处理后，按照TUNEL染色试剂盒操作方法步骤进行处理，通过显微镜观察肿瘤组织细胞凋亡状况；计算凋亡指数(Apoptosis Index, AI)：每张染色切片选取5各视野(各染色切片，选取视野部位保持一致)，分别计数各视野中细胞总数和凋亡细胞数，计算AI：AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

6 凋亡相关蛋白表达的检测 取制备好的石蜡切片，按照SP免疫组织化学试剂盒操作步骤，采用IHC法检测移植瘤组织中凋亡相关的Caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表达；半定量分析：每张染色切片选取5个视野(各染色切片，选取视野部位保持一致)，通过BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)测定各个视野平均光密度值(OD)，以OD值表示肿瘤组织Caspase-3、Bax、bcl-2蛋白表达密度；并根据OD值计算Bax/bcl-2表达比值。

7 统计学方法 运用统计学软件SPSS 15.0进行数理统计分析，计量资料组间均数比较采用One-Way ANOVA分析，两两比较采用LSD-t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组裸小鼠生存状态及移植瘤生长特征 与模型组比较， UA各组和顺铂组荷肺癌裸小鼠精神状态、饮食状况均明显改善，移植瘤组织瘤体较小、活动度和硬度均较低，其中UA 20 mg/(kg·d)组上述效果最为显著。

2 各组裸小鼠移植瘤瘤体重量和抑瘤率 见表1。与模型组比较，UA(10、20 mg/(kg·d))组和顺铂组荷肺癌裸小鼠移植瘤重量显著减轻(P<0.05)，抑瘤率显著升高(P<0.01)；UA 20 mg/(kg·d)治疗组瘤体重量和抑瘤率与顺铂组比较均无显著性差异(P>0.05)。

表1 各组裸小鼠移植瘤瘤体重量和抑瘤率

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 各组裸小鼠移植瘤组织形态结构变化的影响 见图1。与模型组比较，UA各组和顺铂组荷肺癌裸小鼠移植瘤组织细胞呈现不同程度皱缩、数量减少、间隙增大以及片状坏死等明显的病理性形态结构改变，以UA 20 mg/(kg·d)组效果最为显著。

A：模型组；B：UA 5mg/(kg·d)组；C：UA 10mg/(kg·d)组；D：UA 20mg/(kg·d)组；E：顺铂2mg/(kg·d)组

4 各组裸小鼠移植瘤组织细胞凋亡状况的影响见图2及表2。与模型组比较，UA各组和顺铂组荷肺癌裸小鼠移植瘤组织细胞凋亡数量明显增多，以UA 20mg/(kg·d)组最为显著。计算并比较各组荷肺癌裸小鼠移植瘤细胞AI发现：与模型组比较，UA各组和顺铂组移植瘤细胞AI显著升高(P<0.01)；与顺铂组比较，UA 20mg/(kg·d)组移植瘤细胞AI显著升高(P<0.05)。

A：模型组；B：UA 5mg/(kg·d)组；C：UA 10mg/(kg·d)组；D：UA 20mg/(kg·d)组；E：顺铂2mg/(kg·d)组

组 别nAI(%)模型组162.64±1.08UA5mg/(kg·d)组1622.73±4.95**UA10mg/(kg·d)组1639.61±6.87**UA20mg/(kg·d)组1660.94±8.52**△顺铂2mg/(kg·d)组1645.73±6.19**

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，△P<0.05

5 各组裸小鼠移植瘤组织中Caspase-3蛋白表达 见图3及表3。与模型组比较，UA各组和顺铂组荷肺癌裸小鼠移植瘤组织Caspase-3蛋白表达量显著升高，UA 20 mg/(kg·d)组最为显著。半定量分析：与模型组比较，UA各组和顺铂组裸小鼠移植瘤Caspase-3表达OD值显著升高(P<0.05)；与顺铂组比较，UA 20 mg/(kg·d)组Caspase-3表达OD值显著升高(P<0.05)。

A：模型组；B：UA 5mg/(kg·d)组；C：UA 10mg/(kg·d)组；D：UA 20mg/(kg·d)组；E：顺铂2mg/(kg·d)组

6 各组裸小鼠移植瘤组织bcl-2蛋白和Bax蛋白表达 见图4，5及表3。

A：模型组；B：UA 5mg/(kg·d)组；C：UA 10mg/(kg·d)组；D：UA 20mg/(kg·d)组；E：顺铂2mg/(kg·d)组

A：模型组；B：UA 5mg/(kg·d)组；C：UA 10mg/(kg·d)组；D：UA 20mg/(kg·d)组；E：顺铂2mg/(kg·d)组

与模型组比较，UA各组和顺铂组荷肺癌裸小鼠移植瘤组织中Bax蛋白表达量显著降低、bcl-2蛋白表达量显著降低，以UA 20 mg/(kg·d)组最为显著。进行半定量分析：与模型组比较，UA(10、20 mg/(kg·d))组和顺铂组裸小鼠移植瘤组织Bax蛋白表达OD值显著升高且bcl-2蛋白表达OD值显著降低(P<0.05)；UA 20 mg/(kg·d)组bcl-2和Bax表达OD值与顺铂组比较均无显著性差异(P>0.05)。计算Bax/bcl-2表达比值并进行统计分析：与模型组比较，UA各组和顺铂组Bax/bcl-2表达比值显著升高(P<0.05)；与顺铂组比较，UA 20 mg/(kg·d)组Bax/bcl-2表达比值显著升高(P<0.05)。

表3 各组裸小鼠移植瘤组织中Caspase-3、Bax、bcl-2表达OD值及Bax/bcl-2表达比值

注：与模型组比较,*P<0.05，**P<0.01；与顺铂组比较，△P<0.05

讨 论

我国肺癌发生率和致死率据恶性肿瘤之首[4]，目前临床上对肺癌的治疗方案主要有外科手术、放疗、化疗以及分子靶向治疗等[5]。但超过80%的肺癌患者确诊时就已发展为中晚期，已失去手术机会，只能采取放化疗，而放化疗并发症较多，身体较差的晚期肺癌患者难以承受。近年来，中草药及其提取物以毒副作用小的特点，成为肺癌治疗研究的热点。

熊果酸(Ursolic Acid, UA)是一种具有多种生物学活性的五环三萜类化合物[1-5]，近年来熊果酸抗肿瘤活性逐渐得到医药研究工作者的关注，崔兵兵等[3]研究发现：UA能够诱导细胞凋亡而表现出对肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用；UA对卵巢癌、宫颈癌等妇科肿瘤细胞生长具有抑制作用[6]。本研究发现，经UA干预治疗能够明显改善荷肺癌裸小鼠精神状态、饮食状况等一般生存状态，并影响移植瘤组织大小、硬度和活动度；能够显著降低瘤体重量、提高抑瘤率，能够诱导荷肺癌裸小鼠移植瘤细胞凋亡和移植瘤组织坏死；提示UA可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而对荷肺癌裸小鼠移植瘤生长起到抑制作用。

Caspase-3蛋白和Bcl-2蛋白家族(bcl-2、Bax)在细胞凋亡过程中发挥着非常重要的调控作用。Caspase-3能够激活各种凋亡刺激因子而参与细胞凋亡的启动及整个凋亡过程的调节[7-8]；bcl-2可直接与凋亡刺激因子结合而抑制Caspase-3的激活、抑制Bax的细胞毒性作用、改善细胞内钙浓度，从而表现出抑制细胞凋亡的作用[8]；Bax也属于Bcl-2基因家族，能够诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而起到促细胞凋亡作用。进一步研究发现：Bax能够与bcl-2形成异二聚体而抑制bcl-2活性，因此Bax/bcl-2比值更加能够体现Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[9]。

总之，UA可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而对荷肺癌裸小鼠移植瘤生长起到抑制作用，作用机制可能与UA能够调节Caspase-3、bcl-2、Bax蛋白表达有关。

[1] 郝冉冉,王晨静,仲伟珍,等.熊果酸对ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤的保护作用[J].中药药理与临床，2014,30(4):29-32.

[2] 王 翔,阎 昭,王 旭,等.熊果酸纳米脂质体的镇痛作用和抗炎活性[J].山东医药, 2013,53(29):31-35.

[3] 崔兵兵,程丽芳,侯立静,等.熊果酸抑制人肝癌SMMC-7721细胞生长及凋亡的实验研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(18):181-184.

[4] 王德钦,郭新军.晚期肺癌264例生存质量调查及影响因素分析[J].陕西医学杂志, 2013, 42(1):109-111.

[5] 周宏灏,刘 洁.抗肿瘤药物的基因导向性个体化治疗[J].肿瘤药学, 2011,1(1):6-11.

[6] 王丽琴.熊果酸对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响[J].安徽医药,2016, 20(4):647.

[7] 张建荣,柏江锋,潘 强,等.复方桂枝茯苓丸对脑缺血再灌注损伤大鼠Caspase-3 TGF-β1的影响[J].陕西中医,2013,34(8):1087-1089.

[8] 雷怀成,朱方成,魏 来.大鼠马钱子碱中毒肝细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的研究[J].陕西医学杂志,2013,42(3):278-288.

[9] Saeedi-Borujeni MJ,Hami J， Haghir H,etal. Evaluation of Bax and bcl-2 Proteins expression in the rat hippocampus due to childhood febrile seizure[J]. Iran J Child Neurol,2016,10(1):53-60.

(收稿：2016-07-20)

The effects of Ursolic acid on growth inhibition and apoptosis of transplanted lung cancer in nude mice

Chen Kuili, Mao Zhezhe, Hu Yanfeng, et al.

Handan Central Hospital of Hebei Province (Handan 056001)

Objective： To investigate the inhibitive effects and mechanism of Ursolic Acid (UA) on xenografts growth in lung cancer of nude mice. Methods ：The nude mice models bearing lung cancer were made by injecting inoculation human lung cell line A549 were treated with UA(5, 10, 20 mg/(kg·d)) and Cisplatin 2 mg/(kg·d) for 14d. The nude mice general states and tumor growth conditions were observed, the histopathological changes of tumor tissue was observed by HE staining; the tumor cells apoptosis was detected by TUNEL staining; the expression of Caspase-3, Bax,bcl-2 protein were detected by immunohistochemistry (IHC). Results：The nude mice bearing lung cancer were treated with UA for 14 d appeared food situation mental condition were improved, tumor was reduced, activity and hardness were poorer; necrosis presentation, tumor cell shrinkage and other pathological morphological changes appeared, the number of apoptotic cells in tumor tissue was significantly increased; the tumor weight of UA treated groups were significantly decreased and the inhibition rate were significantly increased; the expression of Bax and Caspase-3 were significantly increased, the expression of bcl-2 protein was significantly decreased, and the ratio of Bax/bcl-2 were significantly increased, all of the effects of UA above were dose-dependent with a certain. Conclusion：UA has inhibitive effects on xenografts growth in lung cancer of nude mice, which perhaps related to its effects of regulating the expression of apoptosis-related proteins (Caspase-3, Bax, bcl-2) to promoting tumor cell apoptosis.

Lung neoplasms/drug effective Arctostaphylos/therapeutic use Neoplasms metastasis Growth Animals,laboratory @Mice

肺肿瘤/药物作用 熊果属/治疗应用 肿瘤转移 生长 动物，实验 小鼠

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.05.002