响应面法优化马蹄发酵果醋工艺研究

康超，伍淑婕，李燕，2，段振华，潘中田，帅良，陈振林，罗杨合，*

（1.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；2.大连工业大学，辽宁大连116034）

响应面法优化马蹄发酵果醋工艺研究

康超1，伍淑婕1，李燕1，2，段振华1，潘中田1，帅良1，陈振林1，罗杨合1，*

（1.贺州学院食品科学与工程技术研究院，广西贺州542899；2.大连工业大学，辽宁大连116034）

以马蹄为原料，通过响应面法分析探索液态发酵马蹄果酒、果醋的生产工艺条件。结果表明，马蹄酒精发酵的工艺参数为pH 4.5，温度30℃，时间7 d，接种量3%，马蹄酒精发酵酒精度达14.5%；醋酸发酵最佳工艺条件为初始酒精浓度9.9%，转速143 r/min，发酵温度31.8℃，在此条件下，果醋的酸度为5.638 g/100 mL。

马蹄；果醋；发酵条件；响应面法

马蹄（Chinese water chestnut），学名荸荠（Eleochaurus toberosa），为莎草科荸荠属的地下球茎[1]，果实中富含碳水化合物、多糖、各种维生素、胡萝卜素、脂肪、蛋白质、微量元素、黄酮类及多酚类等营养物质[2-4]。研究表明，马蹄具有调节血脂、调节免疫、抗菌抗氧化等多种生理功能，具有很好的药用价值，是优良的保健食品[2，5-6]。

我国的马蹄产量占全球95%以上，广西贺州、桂林两市马蹄种植面积超过40万亩，产量超过80万t，占我国马蹄产量70%以上。尤其是贺州，享有“世界马蹄看中国，中国马蹄看贺州”的美誉[7-8]。目前，马蹄深加工产品很少，主要是清水马蹄罐头、马蹄果脯及饮料等[7，9]。每年12月到来年2月是马蹄收获期，马蹄市场价为每斤1.5元～2.0元。第二年7月～8月，马蹄市场价为每斤4.0元～6.0元。这是由于马蹄不易贮藏、供应量变少等原因导致的。

随着人们生活水平的提高，马蹄产品的种类和品质已远远不能满足市场消费需求，市场需求越来越多高品质的马蹄新产品。近年来，各种果醋饮品的研究受到越来越多的重视，山楂醋[10-11]，苹果醋[12-14]、木瓜醋[15]、柿子醋[16]、桑果醋[17]、山药醋[18]等各种果醋饮品不断投入研发并投放市场。目前对马蹄醋的研究较少[19-21]，市场上几乎没有马蹄果醋品种，因此深加工发酵制备富含果醋和马蹄药用保健功能的马蹄果醋产品，具有巨大的开发应用前景。本研究以马蹄为原料，响应面法优化马蹄果醋的发酵工艺，旨在为我省市马蹄资源的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜马蹄、白砂糖：市售。

氢氧化钠、柠檬酸等：分析纯；糖化酶、淀粉酶、果胶酶：诺维信生物技术有限公司（100 000 U/g）；安琪活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：北京微生物研究所（菌号AS1.41）。

1.2 仪器与设备

JYZ－A530榨汁机：九阳股份有限公司；ZQZY－VC恒温震荡摇床：上海知楚分析仪器制造有限公司；BSA124S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；SHZ－82A数显恒温水浴锅：江苏金怡有限责任公司；PAL－1糖度计：日本ATAGO（爱拓）科学仪器有限公司；DA－130酒精计：日本京都电子公司；pHS－4C酸度计：成都世纪方舟科技有限公司。

1.3 工艺流程

1.3.1 马蹄水解液制备流程

1.3.2 马蹄果醋发酵工艺流程

1.4 试验内容

酒精发酵条件优化：以酶解后获得的马蹄汁为原料接入酵母种子液进行酒精发酵，分别对接种量、初始pH值、发酵温度及发酵时间进行正交试验，研究其对马蹄酒精发酵阶段的影响。

醋酸发酵条件优化：以获得的马蹄果酒为原料，对pH值、糖度、酸度等进行调整后，接种醋酸菌进行醋酸发酵，分别以初始酒精浓度、转速及发酵温度为影响因素考察其对酸度的影响。根据Box－Behnken试验设计原理，在单因素试验的基础上，采用三因素三水平的响应面分析方法，试验因素与水平设计见表1。

1.5 测定方法

酒精度测定：蒸馏法酒精计测定；糖度测定：糖度计；总酸度测定：酸碱中和滴定法；pH值测定：精密pH计。

表1 响应面试验水平设计Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

2 结果与分析

2.1 马蹄酒精发酵工艺确定

为确定较好的马蹄果酒酒精发酵工艺条件，在前期单因素条件基础上进行正交试验，以接种量（A）、初始pH值（B）、发酵时间（C）、发酵温度（D）为考察因素，以酒精度为考察指标，正交试验结果见表2。

表2 马蹄酒精发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for alcoholic fermentation conditions optimization

由表2可知，试验确定马蹄酒精发酵条件优化时，pH值及温度比对马蹄酒精发酵有较大影响，各因素对发酵酒精度的影响大小顺序依次为：pH值＞温度＞时间＞接种量，由正交试验得知，马蹄酒精发酵最佳组合为A2B2C3D2，即接种量3%，pH 4.5，时间7 d，温度30℃；由于最佳组合没有在正交表的组合中，所以需要做验证试验，验证试验结果表明当组合为A2B2C3D2时，马蹄酒精发酵酒精度达14.5%。因此，选择发酵7 d的马蹄果酒进行过滤及调整成分后，接种醋酸菌种子液进行醋酸发酵。

2.2 马蹄醋酸发酵工艺确定

2.2.1 发酵初始酒精浓度对马蹄醋酸发酵的影响

将酒精发酵浓度调整为6%、8%、10%、12%，在醋酸菌接种量为10%（摇床转速150 r/min，温度30℃）的条件下，考察不同酒精起始浓度对醋酸发酵酸度的影响，见图1。

图1 酒精浓度对醋酸发酵的影响Fig.1 Effects of alcohol content on acetic fermentation

由图1可知，酒精浓度越低，醋酸发酵产酸能力越小，但当酒精浓度达到12%，可能由于其浓度过高，从而抑制醋酸菌的产酸能力，醋酸菌发酵产酸情况没有酒精初始浓度为10%的产酸能力强；同时，研究表明随着醋酸发酵时间的延长，醋酸发酵速率上升缓慢，当酒精初始浓度为10%，醋酸菌发酵7 d，酸度达到5.5 g/100 mL，继续进行发酵，产酸能力并没有得到很大改变。

2.2.2 摇床转速对马蹄醋酸发酵的影响

由于醋酸菌是好氧微生物，当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动，缺氧时会抑制醋酸细菌的生长，因此，将酒精发酵浓度调整为10%，在醋酸菌接种量为10%，发酵温度30℃的条件下，考察不同摇床转速（120、150、180、210 r/min）对醋酸发酵酸度的影响，见图2。

图2 转速对醋酸发酵的影响Fig.2 Effects of rotation rate on acetic fermentation

由图2可知，转速越高，醋酸发酵产酸能力相对会越强，但考虑到生产实际情况，本研究选取120 r/min～150 r/min做后续正交试验研究。

2.2.3 发酵温度对马蹄醋酸发酵的影响

醋酸菌的最适生长温度为30℃～35℃，温度太高或者太低，均不利于醋酸菌的繁殖生长。因此，将酒精发酵浓度调整为10%，在醋酸菌接种量为10%，发酵温度30℃、转速150r/min的条件下，考察不同温度（30、32、34℃）对醋酸发酵酸度的影响，见图3。

图3 温度对醋酸发酵的影响Fig.3 Effects of temperature on acetic fermentation

由图3可知，随着发酵时间的延长，在不同温度条件下，发酵酸度逐渐增加，发酵1 d～3 d，产酸变化幅度不大，随后出现差异，30℃条件下，发酵产酸情况较好。

2.2.4 醋酸发酵条件响应面试验优化

2.2.4.1 响应面优化模型建立分析

应用Box-behnken对马蹄果醋发酵条件进行响应面分析试验，用Design-expert V8.0.6软件对响应面试验结果（表3）进行回归分析，以马蹄果醋发酵获得的醋酸产量（酸度）为Y值（响应值），获得总酸对初始酒精浓度、转速和发酵温度3个因素的二次多项回归模型：

总酸（g/100 mL）=5.58+0.025A-0.10B+0.18C+ 0.30AB-0.10AC+0.05BC-0.17A2-0.42B2-0.52C2。对该模型进行方差分析，结果见表4。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

续表3 响应面试验设计及结果Continue table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表4 响应面二次回归方程模型方差分析结果Table 4 ANOVA results of quadratic regression model for response surface

由表4可知，该模型具有显著性（P＜0.05），模型失拟项0.066 7（＞0.05）不显著，模型的调整确定系数（R2adj）为0.970 5，可解释97.05%响应值的变化，相关系数（R2）为0.987 3，与R2adj较接近，表明此模型拟合程度好，误差不大，故可用此模型对马蹄果醋发酵工艺条件结果进行分析与预测。在总的作用因素中，A，BC均不显著，AC差异显著，B，C，AB，A2，B2，C2均极显著。

2.2.4.2 响应面结果分析与优化

根据回归方程做响应面图及其等高线图，考察所拟合的响应面的形状，分析初始酒精浓度、转速及发酵温度对酸度的影响，相应的响应面见图4～图6。

图4 酒精浓度与转速交互影响醋酸的响应面图（a）及等高图（b）Fig.4 Response surface and contour of effects of initial alcohol content and rotation rate amount on acid content

图5 酒精浓度与发酵温度交互影响醋酸的响应面图（a）及等高图（b）Fig.5 Response surface and contour of effects of initial alcohol content and temperature amount on acid content

图6 转速与发酵温度交互影响醋酸的响应面图（a）及等高图（b）Fig.6 Response surface and contour of effects of rotation rate and temperature amount on acid content

由图可知，该结果与之前的单因素试验结果一致，并且单因素值增加，响应值随之增加，但是当响应值达到某一程度后，会出现下降趋势。综合表2～表3与图4～图6，并进行二次多项回归模型线性拟合后可知，马蹄果醋发酵工艺的最佳条件是：初始酒精浓度9.89%，转速142.74 r/min，发酵温度31.76℃，在此工艺条件下，马蹄果醋发酵产酸的理论值为5.645 g/ 100 mL。为验证响应面试验法获得结果的可信度，根据工艺（初始酒精浓度9.9%，转速143 r/min，发酵温度31.8℃）进行试验，重复3次，平均酸度为5.638 g/ 100 mL，所得试验值与理论值相对误差小，说明经响应面分析方法优化获得的工艺参数是可信的，具有较好的实用价值。

3 结论与讨论

本研究确定马蹄果酒酒精发酵工艺条件，在单因素条件基础上进行正交试验，以接种量、初始pH值、发酵时间、发酵温度为考察因素，结果显示各因素对发酵酒精度的影响依次为pH值＞温度＞时间＞接种量，最佳酒精发酵工艺条件为pH 4.5，温度30℃，时间7 d，接种量3%，马蹄酒精发酵酒精度达14.5%。

本研究通过单因素试验和Box－Behnken设计试验，采用响应面分析法优化马蹄果醋的醋酸发酵工艺条件，得出最佳的发酵工艺参数：初始酒精浓度9.9%，转速143 r/min，发酵温度31.8℃，在此条件下，果醋的酸度为5.638 g/100 mL。本研究建立的二次线性回归模型准确有效，优化马蹄果醋发酵工艺参数是可行的，并且试验拟合较好，有一定的实用价值，可为特色营养发酵马蹄果汁果醋的进一步研究提供参考依据。

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Optimization of Fermentation Conditions for Chinese Water Chestnut Vinegar by Response Surface Methodology

KANG Chao1，WU Shu-jie1，LI Yan1，2，DUAN Zhen-hua1，PAN Zhong-tian1，SHUAI Liang1，CHEN Zhen-lin1，LUO Yang-he1，*
（1.Research Institute of Food Science&Engineering Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

Chinese water chestnut was utilized as raw material to brew fruit vinegar via submerged fermentation. Response surface methodology（RSM）was applied to optimize the fermentation condition.The optimal alcohol fermentation conditions were as follows：pH 4.5，temperature 30℃，time 7 day，yeast inoculum 3%and alcohol content 14.5%.Based on single experiment，the initial alcohol content，rational speed，fermentation temperature were chosen as influencing factors，and the acidity was selected as response value.The optimal fermentation condition were determined as follows：initial alcohol content 9.9%，rational speed 143 r/min，fermentation temperature 31.8℃.Under such optimal conditions，the acidity was 5.638 g/100 mL.

Chinese water chestnut；fruit vinegar；fermentation conditions；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.015

2016－08－16

国家自然科学基金（21365011）；广西自然科学基金（2013GXNSFAA019046）；贺州学院博士启动基金（HZUBS201515）；贺州市科学研究与技术开发计划项目（贺科攻1541004）

康超（1985—），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品工程和天然产物研究与开发。

*通信作者：罗杨合（1969—），男，教授，博士，研究方向：天然产物研究与开发。