同种异体脂肪组织来源干细胞联合地黄低聚糖对心肌梗死小型猪心肌凋亡的影响

裴志勇，曹丹阳，尹巧香，高伟，赵玉生

(1.中国人民解放军陆军总医院干部病房一科，北京 100700；2.中国人民解放军空军总医院干部病房心内科；3.中国人民解放军总医院老年心血管病研究所)

·基础研究·

同种异体脂肪组织来源干细胞联合地黄低聚糖对心肌梗死小型猪心肌凋亡的影响

裴志勇1，曹丹阳1，尹巧香2，高伟3，赵玉生3

(1.中国人民解放军陆军总医院干部病房一科，北京 100700；2.中国人民解放军空军总医院干部病房心内科；3.中国人民解放军总医院老年心血管病研究所)

目的 探讨同种异体脂肪组织来源干细胞(ASCs)联合地黄低聚糖(RGOs)对心肌梗死(MI)小型猪心肌凋亡的影响。方法 球囊封堵冠状动脉前降支制备小型猪MI模型，17头小型猪造模成功，采用随机数字表法分为4组：ASCs组(n=4)，RGOs组(n=4)，RGOs+ASCs组(n=4)及对照组(n=5)。造模前3天、造模后1月RGOs组及RGOs+ASCs组均饲以RGOs粗提物；造模7～10 d经冠状动脉移植ASCs，RGOs组及对照组均注入0.9%氯化钠注射溶液。移植后8周检测心肌梗死边缘区细胞凋亡(TUNEL法)及Bax、Bcl-2的表达。结果 与对照组比较，RGOs组及RGOs+ASCs组心肌细胞凋亡均显著降低(P<0.05，P<0.01)，三组Bax的表达均明显降低(P<0.05)，RGOs组及RGOs+ASCs组Bcl-2的表达均明显升高(P<0.01)。结论 ASCs联合RGOs抑制了梗死边缘区心肌细胞凋亡。

心肌梗死；干细胞移植；地黄；心室重构；模型，动物

急性心肌梗死(AMI)是一种常见的心血管急症，严重威胁着现代人的健康与寿命。现行的“再灌注”治疗虽然可以恢复缺血梗死区血流，但对于已经发生坏死的心肌也无能为力；另外，“缺血再灌注损伤”还会进一步损伤心肌细胞，恶化心功能。现已发现，干细胞具有自我复制以及多向分化潜能，这为缺血性心脏病的再生治疗带来了新的曙光[1]。干细胞存活、分化以及生物学效能的发挥离不开其所处微环境。MI早期梗死区氧化应激、炎性反应强烈，营养物质严重缺乏，这种恶劣的微环境使干细胞存活率极低，改善梗死区微环境是提高干细胞移植率的重要策略。地黄是一种最常用的滋补中药，地黄低聚糖(RGOs)是地黄的主要成分之一，近年研究[2-7]发现，RGOs具有促进骨骼肌成肌细胞、骨髓干细胞及脂肪组织来源干细胞(ASCs)增殖、分化，抗氧化损伤，抗凋亡作用。笔者前期的研究发现[8]，RGOs可以提高ASCs移植治疗小型猪MI疗效，改善心功能，减轻左心室重构，其作用机制可能与RGOs促进ASCs增殖分化，抗纤维化有关。基于以上研究，本文进一步探讨了ASCs联合RGOs对梗死边缘区心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 巴马小香猪，月龄5～7个月，体质量20～30 kg，由中国人民解放军总医院实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(军)2007-009。

Ⅳ型胶原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)，特级胎牛血清(FBS)、Dispase Ⅱ中性蛋白酶(Sigma公司)，TUNEL试剂盒(Roche公司)，羊抗小鼠IgG、山羊血清、小牛清蛋白血清(中杉金桥)，小鼠抗Bcl-2 单克隆抗体(Lifespan biosciences公司)，兔抗Bax多克隆抗体(stressgen公司)，硝酸纤维素膜(Bio-Rad公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)。二氧化碳孵箱(Thermo scientific公司)，低温离心机(Sigma 3K18),普通光学显微镜(Leica DM IL)，倒置相差显微镜(Olympus BX51)。动脉鞘管、冠脉指引导管及冠脉球囊(Cordis)，血管造影机(GE OEC9800),多导生理记录仪(成都RM6240)。RGOs是以生地黄为原料加工后由解放军总医院中医科提纯，高效液相色谱法检测RGOs提纯物中水苏糖含量为31.15%。

1.2 方法

1.2.1 ASCs的分离、培养及鉴定 详见文献[4]。

1.2.2 动物分组及MI模型的制备 17头小型猪成功造模、存活并完成整个实验，采用随机数字表法分为对照组(n=5)、ASCs组(n=4)、RGOs组(n=4)及RGOs+ASCs联合组(n=4)。造模前3 d所有动物均饲以酒石酸美托洛尔(50 mg/d)及阿司匹林肠溶片(100 mg/d),RGOs组及联合组同时饲以RGOs粗提物(4 g，2次/天)。小型猪MI模型制备术前处理，术中操作及术后处理详见文献[8]。

1.2.3 ASCs移植 详见文献[8]。

1.2.4 心脏取材 动物麻醉、称重，经耳缘静脉注入100 mg肝素钠注射液。股动脉放血法使动物致死，开胸取出心脏，垂直左室长轴将左心室切成5～6 mm厚度的薄片，留取心肌梗死边缘区标本-70 ℃保存及4%多聚甲醛固定后保存。

1.2.5 心肌细胞凋亡检测(TUNEL法) 每头小型猪随机留取3张梗死边缘区切片计算心肌细胞凋亡。方法如下：①切片脱蜡、水化；②加蛋白酶K(20 μg/mL)),37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS漂洗3次，每次5 min；③加3 %小牛血清清蛋白及20 %山羊血清,20 min；④加反应液50μL，置湿盒内37 ℃孵育1 h，0.01 M PBS漂洗3次，每次5 min；⑤重复步骤③；⑥加1∶2稀释的HRP连结抗荧光素抗体20μL，置湿盒内37 ℃孵育30 min；0.01 M PBS漂洗3次，每次5 min；⑦显微镜下观察DAB-H2O2显色，当细胞核呈深棕色时自来水冲洗终断反应，苏木精染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。每张切片随机选取5个非重叠视野(×400)，计数心肌细胞总数及凋亡心肌细胞数，计算凋亡率。

1.2.6 梗死边缘区Bax、Bcl-2的表达 RIPA裂解液提取各组心肌总蛋白，BCA法检测样品蛋白浓度。蛋白样品和蛋白上样缓冲液按1∶4(V∶V) 混合，100 ℃加热5 min。12 %聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，完毕后将蛋白转至硝酸纤维素膜，转膜后经5 %脱脂奶粉室温下封闭1 h，TTBS杂交液漂洗3次，加入一抗(Bax，1∶200；Bcl-2，1∶200)，4 ℃过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗，以ECL化学发光法进行检测。β-actin 为内参对照。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料两组间比较采用t检验，多组之间比较先采用F检验而后进行q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小型猪ASCs形态学观察及ASCs表面抗原表达 详见参考文献[4]。

2.2 梗死边缘区心肌细胞凋亡指数 各组心肌细胞凋亡指数分别为(21.02±1.83)%，(17.28±1.06)%，( 18.9±1.61)%，(12.68±1.88)%。与对照组比较，RGOs组及联合治疗组凋亡指数均明显降低(P<0.05，P<0.01)，而ASCs组差异无统计学意义；ASCs组与RGOs组凋亡指数比较,差异无统计学意义，而联合治疗组凋亡指数明显低于单纯RGOs及ASCs治疗组(均P<0.01)(图1)(F=20.1052,P=0.0000)。

与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与RGOs组比较，cP<0.01；与ASCs组比较，dP<0.01

图1 移植后8周各组梗死边缘区心肌细胞凋亡指数

2.3 梗死边缘区Bax、Bcl-2表达 图2示各组Bax、Bcl-2的表达。Bax半定量分析：与假手术(Sham)组比较，对照组Bax水平明显升高(P<0.01)；干预治疗后ASCs组、RGOs组及联合治疗组Bax水平均明显低于对照组(P<0.01，P<0.05，P<0.01)(图3)(F=13.5858,P=0.0005)。Bcl-2半定量分析：与假手术(Sham)组比较，对照组Bcl-2水平明显降低(P<0.01)，干预治疗后RGOs组、联合治疗组Bcl-2的水平均明显高于对照组(均P<0.01)；而ASCs组与对照组比较,差异无统计学意义(图4)(F=34.1665,P=0.0000)。

sham：假手术组

与假手术组比较，aP<0.01；与对照组比较，cP<0.05；bP<0.01；sham：假手术组

图3 各组Bax的表达

与假手术组比较，aP<0.01；与对照组比较，bP<0.01；sham：假手术组

图4 各组Bcl-2的表达

3 讨论

目前研究发现，细胞凋亡受多条信号通路调控，如线粒体通路、内质网通路及死亡受体通路。各种引起细胞凋亡的因素均可以破坏线粒体膜，使线粒体膜通透性转变孔道开放，线粒体跨膜压下降及通透性增加，激活胞浆内的caspase，导致细胞凋亡[9]。Bcl-2蛋白家族在调节线粒体通透性及细胞凋亡信号转导中发挥了关键作用。根据Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中发挥的生物效应不同可分为以下两类，①促凋亡蛋白：如Bax、Bak、Bad、Bid、Bim、Bik、Bok、Puma等；②抗凋亡蛋白：如Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xl、Mcl-1等；其中，Bax与Bcl-2之间的平衡在细胞是否发生凋亡中发挥重要作用[10]。

RGOs是从地黄中提取的低分子量多糖成分，药理研究表明，地黄多糖对于正常及病理动物具有较好的抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、增强免疫功能、促进造血等作用[11]。近年研究发现，RGOs还具有促进骨骼肌成肌细胞、脂肪间充质干细胞增殖[2-4]，诱导骨髓造血干细胞分化成心肌样细胞及神经样细胞的作用[12-13]。多位学者对于地黄及其组分抗氧化、抗缺血性损伤进行了深入研究。杨兵等[14]研究发现，地黄多糖可以降低正常动物血清丙二醛含量，增强血清谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。Huang等[15]研究发现，缺血再灌注前给予梓醇处理，可以明显降低大鼠心肌细胞凋亡和心肌坏死，改善心功能，其作用机制与降低过氧亚硝基阴离子的形成，增加蛋白激酶、内皮型一氧化氮合酶磷酸化和一氧化氮的生成，提高抗氧化能力，降低一氧化氮合酶表达和超氧阴离子自由基的在心肌缺血再灌注心脏中的产生有关。另一研究[16]发现，梓醇预处理后可以明显减少星形胶质细胞数目，增加神经元及微血管数量，使胞体和突起数目及形态趋近于正常，提示梓醇具有保护神经血管单元、促进脑缺血后神经功能恢复的作用。程小丽等[17]研究发现，经地黄饮子孵育的骨髓间充质干细胞移植可以明显增加脑缺血损伤大鼠脑组织Bcl-2蛋白的表达，抑制Bax蛋白的表达，从而调节Bcl-2/Bax的表达，抑制细胞凋亡。彭辉[18]研究显示，地黄多糖能够通过抑制氧化应激损伤和细胞凋亡对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞起到一定的保护作用,其作用机制可能与改善抗氧化酶活性，提高Bcl-2/Bax的表达，抑制促凋亡蛋白caspase-3表达有关。

笔者前期的研究发现[8]，ASCs联合RGOs使小型猪心肌梗死体积明显缩小，梗死区室壁厚度显著增加，同时心功能进一步改善；其可能的机制包括RGOs促微血管形成，提高ASCs存活率，促进ASCs向心肌细胞分化，抗纤维化，改善心室重构。基于以上研究，本研究进一步探讨了ASCs联合RGOs对梗死边缘区心肌细胞凋亡的影响。本研究发现，单纯RGOs组心肌细胞凋亡指数明显小于对照组，而联合治疗组心肌细胞凋亡指数又显著低于单纯RGOs组；本研究还显示RGOs既能下调Bax的表达，又能上调Bcl-2的表达，而ASCs仅能下调Bax的表达，对于Bcl-2的表达无明显上调作用。提示RGOs具有抗心肌细胞凋亡的作用，ASCs可能也有潜在的抗心肌细胞凋亡作用，而两者联合抗凋亡作用最强。本研究发现，ASCs联合RGOs可以明显减少心肌梗死边缘区细胞凋亡，其可能的机制与调节Bax/Bcl-2的表达有关。这为ASCs联合RGOs改善MI小型猪心功能提供了新的证据。

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Effect of a combination of allogenic adipose tissue-derived stem cells and rehmannia glutinosa oligosaccharides on apoptosis of miniswine with myocardial infarction

PeiZhiyong*,CaoDanyang，YinQiaoxiang，GaoWei，ZhaoYusheng

(﹡DepartmentofGeriatricCardiology,ArmyGeneralHospitalofPLA,Beijing100700,China)

Objective To investigate the effect of a combination of allogenic adipose tissue-derived stem cells (ASCs) and Rehmannia Glutinosa Oligosaccharides (RGOs) on the apoptosis of miniswine with myocardial infarction (MI).Methods MI was induced in miniswine hearts by occlusion of the left anterior descending artery for 90 minutes.The survived animals after MI were divided into four groups and received intracoronary ASCs (ASCs,n=4) 7 to 10 days later,intracoronary saline in combination with RGOs(RGOs,n=4) ((administration crude extract of RGOs from 3 days prior to MI to one month post MI),intracoronary ASCs in combination with RGOs (ASCs+RGOs,n=4),or remained untreated (control,n=5).The apoptosis of border zone and the expression of Bcl-2 and Bax were detected eight weeks after transplantation.Results The administration of RGOs significantly inhibited cardiomyocyte apoptosis of border zone in RGOs and RGOs+ASCs groups(P<0.05 andP<0.01).The expression of Bax in ASCs，RGOs and RGOs+ASCs groups was significantly decreased (P<0.05)，and the expression of Bcl-2 in RGOs and RGOs+ASCs groups was significantly increased (P<0.01) compared to the control group.Conclusion The combination of ASCs and RGOs could reduce the apoptosis of peri-infarct myocardium.

Myocardial infarction;Stem cell transplantation;Rehmannia glutinosa；Ventricular remodeling；Models,animal

国家高科技研究发展计划(2006AA02A105)

裴志勇，副主任医师，Email:peizy6618222@sina.com

R542.22

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.02.018

2017-01-06)