半仿生酶法提取柿叶中总黄酮的工艺筛选及优化Δ

薛璇玑，罗 俊，张新新，钱春香，赵 晶，郭增军（西安交通大学药学院，西安 710061）

·制剂与工艺·

半仿生酶法提取柿叶中总黄酮的工艺筛选及优化Δ

薛璇玑＊，罗 俊，张新新，钱春香，赵 晶，郭增军#（西安交通大学药学院，西安 710061）

目的：筛选提取柿叶中黄酮的方法及最优提取工艺。方法：以浸膏质量、黄酮含量为指标，比较乙醇回流法、酶法（纤维素酶、β-葡聚糖酶及二者等量混合组成的复合酶）、半仿生法和半仿生酶法（同前3种酶）提取柿叶中总黄酮的效果。以黄酮含量为指标，以料液比、回流温度和回流时间为因素，设计正交试验优化半仿生酶法提取柿叶中黄酮的工艺条件，并进行验证试验。结果：在4种提取方法中，以半仿生酶法得到的浸膏质量和黄酮含量最高，并以复合酶效果最好；优化的半仿生酶法提取工艺条件为料液比1∶14、回流温度50℃、回流时间2.0 h；验证试验中3次黄酮提取率分别为5.9%、5.8%、5.9%（RSD＝0.98%，n＝3）。结论：优化后的半仿生酶法提取柿叶中黄酮，提取率高且工艺稳定。

半仿生酶法；柿叶；黄酮；提取；正交试验；工艺优化

柿叶为柿树科柿树属植物柿（Diospryros kaki L.f.）的新鲜或干燥的叶，具有生津止渴、清热解毒、润肺强心、镇咳止血等功效[1-2]。柿叶中含有黄酮类、三萜类以及维生素类等成分，其中黄酮类为其主要成分，包括目前已发现的黄芪苷、紫云苷、异槲皮苷、槲皮素、异槲皮素、山柰酚、杨梅树皮苷、芦丁、金丝桃苷等[3-4]。近年来，黄酮类化合物因有降脂、抗血栓、抗心律失常等药理作用，而且具有毒性低、资源丰富、易于工业化提取制备等优点，被广泛地用于医药食品等行业，极具开发价值[5]。

传统提取黄酮类化合物的方法主要包括水煎煮法、碱提酸沉法和浸渍法，这些方法存在工作量大且提取率不高的不足[6]。如果在提取前加入合适的酶（果胶酶、纤维素酶等）对药材进行处理，可通过其溶解细胞壁组成成分果胶和纤维素来破坏药材细胞结构，有效地加快提取进程，提升提取效率[7]。半仿生酶法即是在酶法的基础上，融入了半仿生法的优势，在模拟胃肠道环境的过程中，促进中药中活性成分的富集[8-9]。

目前，关于柿叶中总黄酮提取的文献报道较多[2，10-12]，但对采用不同酶进行提取的比较研究较少，且尚未有采用半仿生酶法提取的报道。为深入研究柿叶中总黄酮的提取工艺，提高其提取率，笔者以浸膏质量和总黄酮含量为指标[13-14]，对比分析了乙醇回流法、酶法、半仿生法及半仿生酶法对柿叶总黄酮的提取率；并以提取温度、时间和料液比作为3个考察因素，采用正交试验考察半仿生酶法提取柿叶总黄酮的最优工艺条件[15]，为柿叶总黄酮的提取提供一种新的高效方法。

1 材料

1.1 仪器

HH-恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；EYEL4系列旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；101-2干燥箱（上海昕仪仪器仪表有限公司）；紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；AE240电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ3200B超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 药材、药品与试剂

柿叶（2014年8月采自陕西蓝田县，经本课题组郭增军教授鉴定为柿树科柿树属植物柿树的干燥叶）；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707，纯度：98%）；纤维素酶、β-葡聚糖酶（和氏璧生物技术有限公司，批号：GB11.006，酶活力：均为30 000 U/g）、复合酶（取纤维素酶、β-葡聚糖酶等量混匀自配）；95%乙醇、10%硝酸铝溶液、5%亚硝酸钠溶液、4%氢氧化钠溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液均为分析纯、自配；水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 柿叶中总黄酮的提取

[7]方法提取。

2.1.1 乙醇回流法 取粉碎后的柿叶约5 g置于圆底烧瓶中，加入10倍量的70%乙醇，70℃加热回流1 h，过滤；滤渣加入8倍量的70%乙醇，加热回流2次，每次1 h，合并滤液；回收溶剂并于80℃真空干燥，得干浸膏。

2.1.2 酶法 取粉碎后的柿叶约5 g置于圆底烧瓶中，加入复合酶0.025 0 g[7]，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液50m L，调节pH为3.6左右，50℃水浴中酶解2 h，过滤；药渣加入50m L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，70℃回流3次，每次1 h，合并滤液；回收溶剂并于80℃真空干燥，得干浸膏。

换用纤维素酶和β-葡聚糖酶重复操作，分别得干浸膏。

2.1.3 半仿生法 取粉碎后的柿叶约5 g置于圆底烧瓶中，加入50m L pH为2.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液为提取液，70℃下回流提取1 h，过滤；滤渣加入50m L pH为7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液为提取液，70℃下回流提取1 h，过滤；滤渣加入50m L pH为8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液为提取液，70℃下回流提取1 h，过滤；合并3次滤液，回收溶剂并于80℃真空干燥，得干浸膏。

2.1.4 半仿生酶法 取粉碎后的柿叶约5 g置于圆底烧瓶中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液50m L为浸取剂，调节pH为2.0，混匀，70℃水浴中回流1 h，过滤；滤渣加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH为3.6，加入复合酶0.025 0 g，混匀，50℃水浴中浸泡2 h，过滤；滤渣加入50m L pH为7.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液为提取液，70℃下回流提取1 h，过滤；滤渣加入50m L pH为8.3的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液为提取液，70℃下回流提取1 h；合并滤液，回收溶剂并于80℃真空干燥，得干浸膏。

换用纤维素酶和β-葡聚糖酶重复操作，分别得干浸膏。

2.2 总黄酮含量测定

黄酮含量测定采用硝酸铝络合分光光度法。其原理是黄酮类化合物经亚硝酸钠还原后，与硝酸铝络合生成稳定的红橙色化合物，此化合物在510 nm波长处有最大吸收，然后以芦丁为标准，通过测定吸光度（A）计算含量[14]。

2.2.1 芦丁标准曲线绘制 精密称取芦丁对照品0.010 3 g置于50m L量瓶中，以60%乙醇溶液溶解定容，得质量浓度为0.206mg/m L的芦丁对照品溶液。依次取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0m L至25m L量瓶中，分别每隔6m in加入5%亚硝酸钠溶液1.0m L、10%硝酸铝溶液1.0m L、4%氢氧化钠溶液10.0m L，再以60%乙醇溶液定容。静置15min后，在波长为510 nm下测定A。以质量浓度（c，mg/m L）为横坐标、A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A＝14.372c－0.007 6（R2＝0.999 6），得芦丁检测质量浓度线性范围为8.24～57.68μg/m L。

2.2.2 方法学考察 （1）精密度试验。精密量取供试品溶液5m L至25m L量瓶中，同“2.2.1”项下方法处理，测定A，重复6次。结果RSD＝0.45%（n＝3），表明方法精密度良好。（2）重复性试验。精密量取样品溶液5m L至25m L量瓶，同“2.2.3”项下方法处理，测定A，重复6次。结果RSD＝0.31%（n＝3），表明方法重复性良好。（3）稳定性试验。取样品溶液分别于放置0、2、4、6、8、12、24 h后同“2.2.3”项下方法处理，测定A，结果RSD＝0.83%（n＝3），表明样品溶液在24 h内稳定。（4）准确度试验。精密量取样品溶液5m L及2m L对照品溶液（0.412mg）至25m L量瓶中，同“2.2.3”项下方法处理，平行制备6份，测定A，计算平均回收率为98.20%（RSD＝0.56%，n＝3），表明方法准确度高。

2.2.3 样品含量测定方法 精密称取样品浸膏0.050 0 g，溶解定容至50m L量瓶中，得到样品溶液。精密量取5.0m L至25m L量瓶中，加入1.0m L 5%亚硝酸钠溶液，摇匀静置6m in；加入1m L 10%硝酸铝溶液，摇匀后静置6m in；加入4%氢氧化钠10m L，用60%乙醇定容至刻度，静置15min。在510 nm波长处测定A，将各组A数据代入回归方程中计算黄酮含量。

2.3 不同方法提取柿叶总黄酮结果比较分析

对乙醇回流法、半仿生法、酶法和半仿生酶法所提取的浸膏称质量并测定其总黄酮含量，计算黄酮提取率（%）＝浸膏中黄酮总量（g）/药材称量（g）×100%，结果见表1。

表1 不同提取方法的比较Tab 1 Com parison of differentextractionm ethods

由表1可知，从浸膏总质量和黄酮提取率分析，半仿生酶法＞半仿生法＞酶法＞乙醇回流法。半仿生法通过模拟药物在人体的pH梯度，能够有效提高提取率，比传统的乙醇回流法提高了67.6%。酶法通过破坏中草药的细胞壁，增大了内容化学成分的溶出；在3种酶中，最适宜柿叶中黄酮提取的酶为复合酶，其提取率比传统方法提高了61.8%。半仿生酶法结合了酶法与半仿生法的优势，取得了更好的提取效果。使用复合酶的半仿生酶法比传统提取法的提取率提高了76.5%，比半仿生法提高了5.3%，比酶法提高了9.1%。由此表明，半仿生酶法在上述几种提取柿叶黄酮的方法中效率较高，且以采用复合酶最优。

2.4 半仿生酶法提取柿叶中黄酮的工艺优化

通过上述对提取方法的比较，初步选择半仿生酶法（复合酶）为提取方法。以回流温度（A）、回流时间（B）和料液比[C，即每次回流提取时药材量（g）与提取液量（m L）之比]作为考察的3个因素，以黄酮提取率为评价指标，设计L9（34）正交试验对半仿生酶法进行条件优化。因素与水平见表2；正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。

表2 因素与水平Tab 2 Factorsand levels

表3 正交试验结果Tab 3 Resultsoforthogonal test

表4 方差分析结果Tab 4 Analysis resultof variance

由表2、表3可知，极差分析和方差分析结果一致，因素影响大小排序为C＞A＞B。由于随着回流温度的升高，黄酮提取率呈先升高再降低的趋势，提示温度升高有利于黄酮被充分提取，但回流温度＞70℃时可能部分有效成分被破坏。由A因素的P＞0.05可知，温度对提取率影响不显著，故选择较低的50℃为回流温度，既节省能源又可避免高温对化合物的破坏。等量原料下，随着提取溶剂的增加，黄酮提取率呈先下降再升高的趋势，可能的原因为在料液比1∶12时，黄酮未被充分提取而且被稀释；而在料液比为1∶14时提取率最大，表明提取出的黄酮已抵消了稀释带来的影响，故选择此料液比较为合理。随着回流时间的延长，黄酮提取率呈逐渐上升趋势，故选择2 h较为合理。综上，最优工艺为A1B3C3，即料液比1∶14、回流温度50℃、回流时间2.0 h。

2.5 工艺验证试验

取粉碎后的柿叶约100 g，共3份，采用优化的工艺条件分别进行提取，测定黄酮含量并计算其提取率。结果，3次试验黄酮提取率分别为5.9%、5.8%、5.9%（RSD＝0.98%，n＝3），与正交试验结果最高值相当，表明优化的工艺提取率较高，且工艺稳定、方法可行。

3 讨论

柿叶为柿树科柿树属植物柿树的叶，含有大量以黄酮类化合物为代表的具有药理活性的化学成分，目前已广泛地应用于医疗和保健行业，具有广阔的应用前景和开发价值。本文从提取柿叶中总黄酮的角度出发，在半仿生法的基础上加入了纤维素酶和果胶酶以破坏细胞壁、加快有效成分溶出，并对比分析了乙醇回流法、半仿生法、酶法及半仿生酶法的浸膏得率和黄酮提取率，发现半仿生酶法提取率较高。因此，在前期确定的最优酶用量的基础上[7-8，16]，进一步设置了回流温度、回流时间和料液比3个参数，采用正交试验优化半仿生酶法提取柿叶中黄酮的工艺条件。本试验为柿叶中黄酮的提取以及半仿生酶法的推广提供了一定的依据。

参考文献

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Screening and Optim ization of the Extraction Technology of Total Flavonoids in Persimmon Leaves by Sem i-bionic-enzyme M ethod

XUE Xuanji，LUO Jun，ZHANG Xinxin，QIAN Chunxiang，ZHAO Jing，GUO Zengjun（School of Pharmacy，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）

OBJECTIVE：To screen themethod for extracting total flavonoids in persimmon leaves and optim ize extraction technology.METHODS：Using extract quality and flavonoids content as indexes，the effects of extracting total flavonoids in persimmon leaves by ethanol refluxing method，enzymemethod（cellulase，β-glucanase and complex enzymemixed by equal amounts of both），sem i-bionic method and sem i-bionic-enzyme method（the same enzymes）were compared.Using flavonoids content as index，solid-liquid radio，reflux temperature，reflux time as factors，orthogonal testwas designed to optimize the extraction technology conditions of flavonoids in persimmon leaves by sem i-bionic-enzyme method，and the verification test was conducted.RESULTS：The extract quantity and flavonoids content by semi-bionic-enzymemethod was the highest among the 4 extraction methods，and the complex enzyme was themost suitable；the optim ized extracting condition of sem i-bionic-enzymemethod were as follows as solid-liquid radio of 1∶14，reflux temperature of 50℃，reflux time of 2.0 h；extraction rates of flavonoids in 3 verification tests were 5.9%，5.8%，5.9%（RSD＝0.98%，n＝3）.CONCLUSIONS：The optimized semi-bionic-enzyme method is efficient and stable in extracting flavonoids in persimmon leaves.

Semi-bionic-enzymemethod；Persimmon leaves；Favonoids；Extraction；Orthogonal test；Technology optimization

R284.2

A

1001-0408（2017）13-1813-04

2016-08-23

2016-09-21）

（编辑：刘 萍）

国家自然科学基金资助项目（No.81172957）；陕西省自然科学基础研究计划项目（No.2016JM 8075）

＊博士研究生。研究方向：天然药物。电话：029-82655133。E-mail：xuanji0423@126.com

#通信作者：教授，博士生导师，博士。研究方向：中药及天然药物资源及活性成分。电话：029-82655133。E-mail：guozj@mail.xjtu. edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.24