嗅鞘细胞分泌蛋白IGFBP-2对神经干细胞分化的作用

邓裕佳，段 答，卓 毅，严卫萍，卢 明，滕晓华

（湖南师范大学第二附属医院，解放军第163医院，长沙 410003）

嗅鞘细胞分泌蛋白IGFBP-2对神经干细胞分化的作用

邓裕佳，段 答，卓 毅，严卫萍，卢 明，滕晓华

（湖南师范大学第二附属医院，解放军第163医院，长沙 410003）

目的：探讨嗅鞘细胞分泌蛋白IGFBP-2在诱导神经干细胞（NSCs）分化过程中的作用。方法：采用新生1 d昆明小鼠嗅球培养嗅鞘细胞（OECs），并制备无血清上清液。C17.2 NSCs置于含10% FBS的DMEM/F12培养基培养，传至第3代，待细胞生长至80%融合时，分别加入OECs无血清上清液（实验组）、H-DMEM/F12培养基（对照组）培养；实验组和对照组均分别加入终浓度为0 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL的IGFBP-2。倒置显微镜下观察诱导后细胞生长情况，于诱导5d后收集各组细胞，行Western blot检测细胞巢蛋白（Nestin）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）及β-微管蛋白Ⅲ（TUJ-1），蛋白激酶1/2（ERK 1/2）表达情况，免疫荧光染色鉴定GFAP，TUJ-1阳性细胞并计数，流式分析GFAP，TUJ-1阳性细胞。结果：Western blot、流式分析示对照组中各浓度组GFAP、TUJ-1表达差异无统计学意义；Western blot示实验组随IGFBP-2浓度升高，GFAP表达增多，TUJ-1表达减少，且加入IGFBP-2后ERK1/2表达迅速增多，免疫荧光鉴定表明，随着IGFBP-2浓度升高，GFAP阳性细胞增多，TUJ-1阳性细胞减少，结果有统计学意义。结论：IGFBP-2可以促进OCM诱导NSCs向星形胶质细胞分化，且与浓度呈正相关，其机制与ERK1/2通路有关。

IGFBP-2；神经干细胞；诱导分化；嗅鞘细胞

嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）是来源于嗅球和嗅神经层的独特胶质细胞，拥有雪旺氏细胞和星形胶质的共同特征。越来越多的研究表明，OEC可以促进轴突再生、穿越胶质瘢痕、改善损伤处微环境等，而这可能得益于嗅鞘细胞条件培养基（OEC-conditioned medium，OCM）中的诸多分泌蛋白。最近有研究表明，OCM可以促进神经干细胞（neural stem cells，NSCs）向神经元分化［1］，但Zhang等人的实验却表明，OCM能抑制NSCs向神经元分化，并促进其向胶质细胞分化［2］。我们猜测这种矛盾可能是由于两个实验中OECs纯度或状态的不同，从而导致OCM中的某种分泌蛋白浓度不同，而这种蛋白的含量变化可能与NSCs分化方向有重要关系。

胰岛素样生长因子结合蛋白-2（insulin-like growth factor binding protein-2，IGFBP-2）与神经系统关系密切，其不仅是IGFBP家族中在中枢神经系统中含量最多的一员，还是成人脑脊液中的主要蛋白［3］。另外，IGFBP-2在各级胶质瘤中均有表达，并随着胶质瘤恶性程度的增加，IGFBP-2的表达水平也随之增加，高级别胶质瘤患者血浆中IGFBP-2浓度远远高于低级别胶质瘤患者和正常人［4］。并且，我们的前期研究表明，OECs可高表达IGFBP-2。因此，我们猜测IGFBP-2在OCM诱导NSCs分化过程中起到重要作用。

为此，本实验通过在无血清培养基和OCM中添加不同浓度的外源性IGFBP-2，观察其对NSCs分化的影响，并验证其可能信号通路。

1 材料与方法

1.1 材料 新生昆明小鼠（出生1 d）10只，雌雄不限，体重3～5 g（中南大学湘雅医学院动物部），达尔伯克改良培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）（Gibco），胰蛋白酶（Gibco），阿糖胞苷（Arabinofuranosyl Cytidine，Ara-C）（Sigma），多聚赖氨酸（Sigma），胎牛血清（Hyclone），IGFBP-2（R&D），兔抗小鼠巢蛋白（Nestin）一抗（Abcam），ERK1/2一抗（proteintech），p-ERK1/2一抗（Abcam），神经胶质酸性蛋白（GFAP），兔抗小鼠β-微管蛋白Ⅲ（TUJ-1）一抗（Abcam），β-actin一抗（Protein Tech），荧光显微镜（Leica），Quantity One 软件（Bio-Rad），C17.2 NSCs 系由中国科学院药物研究所李佳老师赠予。

1.2 小鼠OECs的分离培养及上清液制备 参考文献方法培养小鼠OECs及制备OCM［5］，取新生1 d 的昆明小鼠10 只，浸入络合碘中溺死，在超净台内充分显露两侧大脑半球、小脑及嗅球，完整剥取嗅球。预冷的PBS 的轻柔洗涤3次，在解剖显微镜下仔细剥离嗅球表面血管和软脑膜，余下嗅球组织用眼科剪剪碎，置于37℃ 0.25%的胰蛋白酶中消化15 min，DMEM（含10% 胎牛血清）终止消化，巴氏管轻柔吹打后细胞筛过滤，离心滤液（800 r /min，8 min），弃上清后以DMEM（含10%胎牛血清）重悬细胞，接种入未包被的培养瓶（细胞密度5×104/mL）并置于37℃ 5% CO2培养箱中。培养1h 后轻振培养瓶，吸出细胞悬液种植到另一未包被的培养瓶中，培养8h 后，将细胞悬液接种到已使用多聚赖氨酸包被的培养瓶中。继续培养4 h后使用2 mg /L 的AraC处理细胞，培养4 h 后全量换液。每培养3 d半量换液一次。当细胞生长融合达到80% 时吸出上清，PBS 清洗3 次，加入新鲜培养基（无血清DMEM）孵育1 d，离心15 min后收集上清，-20℃保存备用。

1.3 实验分组 实验分为对照组和实验组，对照组：DMEM/F12培养基培养的正常第3代C17.2 NSCs；实验组：取第3代C17.2 NSCs，弃含血清培养基，PBS清洗2次，加入OECs无血清上清液培养。实验组和对照组均分别加入终浓度为0 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL的IGFBP-2诱导5 d。

1.4 Western blot 检测 经不同浓的外源性IGFBP-2诱导5 d后，收集各组细胞，采用SDS Samplebuffer裂解，Bradford蛋白定量。取蛋白50μg，10%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶电泳2h，转膜，分别加入Nestin一抗（1：1000）、TUJ-1一抗（1：1000），GFAP一抗（1：1000）、总蛋白激酶1/2（total-extracellular regulated protein kinases 1/2，t-ERK 1/2）一抗（1：2000），活化蛋白激酶1/2（positive-extracellular regulated protein kinases 1/2，p-ERK 1/2）一抗（1：500），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次。以1：2000比例稀释二抗，TBST洗膜3次，于暗室加1mL显影A、B混合液，根据荧光强度选择不同曝光时间，扫描仪获取荧光图谱。采用Quantity One软件分析免疫条带，以目的蛋白与内参β-actin的吸光度（A）值比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.5 免疫荧光检测及计数 对实验组中经不同浓度IGFBP-2诱导5 d后的C17.2 NSCs进行免疫荧光鉴定。步骤：细胞经4%多聚甲醛固定5 min，PBS清洗3次，山羊血清封闭20 min，分别加入一抗GFAP（1：1000）、TUJ-1（1：1000）、兔抗p75（1：500），4℃过夜，常温下加入免疫荧光二抗孵育1h，清洗3次后滴加DAPI染核，荧光显微镜下观察，GFAP阳性表达呈绿染，TUJ-1为红染。技术方法：荧光显微镜下，随机选取8个视野，计算亮绿色（GFAP）和深红色（TUJ-1）的细胞个数。

1.6 流式细胞检测 对照组诱导5 d后分析细胞TUJ-1和GFAP的表达。每个培养瓶去培养基，PBS洗1遍，加入200μL 0.02%EDTA消化，用含血清的培养基终止反应，巴氏管轻柔吹打，离心后弃上清，PBS洗1遍，用PBS制成悬液每份1×105个细胞调整到100μL，按照说明书在细胞悬液中直接加入抗体，冰上避光孵育60 min，以1300 r/min离心3 min弃含荧光标记抗体的PBS，再用PBS洗一遍，去除未结合荧光抗体，降低背景干扰，100μL Buffer重悬细胞，在4℃下保存待测；用间接荧光标记的抗体时，首先加1μL一抗，冰上孵育60 min，用PBS洗一遍，再加1μL二抗（FITC标记），避光冰上孵育40 min，PBS洗一遍，100μL Buffer重悬细胞，在4℃下保存待测。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验；检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 OECs的培养与鉴定 体外培养OECs生长3d后细胞呈三角形、梭形或椭圆形，有突起细长（图1A），胞体折光性较好，细胞不规则排列，7d后行NGFR p75免疫荧光染色可见大量阳性细胞（图1B）

图1 嗅鞘细胞的形态学观察及鉴定A：OECs形态观察（Scale bar =200 μm）；B：OECs 的p75 免疫荧光染色观察（Scale bar =50 μm）

2.2 外源性IGFBP-2在无血清培养基中对NSCs的分化无明显作用 C17.2 NSCs用血清培养融合至80%时，弃上清，PBS洗3遍，加入DMEM/F12培养基。分别在培养基中加入终浓度为0 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL的IGFBP-2，诱导5 d后行western blot检测和流式分析。结果均显示诱导前后胶质细胞标志物GFAP和神经元标志物TUJ-1无明显改变（图2A，2B-M），差异无统计学意义（P＞0.05）。证明不同浓度的外源性IGFBP-2加入DMEM/F12培养基后，对NSCs的分化无明显作用。

图2 单独添加外源性IGFBP-2对NSCs分化无明显影响A：IGFBP-2诱导5 d后，各浓度组GFAP和TUJ-1的western blot表达，差异无统计学意义，P＞0.05；B：IGFBP-2诱导5 d后，各浓度组GFAP和TUJ-1的流式分析，R2，R3差异无统计学意义，P＞0.05。其中图B、C、D 为0 ng/mL IGFBP-2诱导组；E、F、G为125 ng/mL IGFBP-2诱导组；H、I、J为250 ng/mL IGFBP-2诱导组；K、L、M为500 ng/mL IGFBP-2诱导组；R 1为总检测细胞，R 2为GFAP阳性细胞，R 3为TUJ-1阳性细胞。

2.3 外源性IGFBP-2在OCM中诱导NSCs分化

C17.2 NSCs用血清培养融合至80%时，弃上清，PBS 洗3遍，加入OECs无血清上清液培养。分别在培养基中加入终浓度为0 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL的IGFBP-2，诱导5 d后行western blot检测和免疫荧光分析。Western blot结果显示随着IGFBP-2浓度的增加，GFAP表达逐渐增多，TUJ-1和未分化细胞标志物逐渐减少（图3A，3B）。免疫荧光检测到随着IGFBP-2浓度的增加，GFAP阳性细胞逐渐增多，TUJ-1阳性细胞逐渐减少（图3C，3D）。结果表明，外源性IGFBP-2促进NSCs向星形胶质细胞分化，抑制NSCs向神经元分化，且与浓度呈正相关关系。

图3 外源性IGFBP-2在OCM中诱导NSCs向星形胶质细胞分化A-B：外源性IGFBP-2诱导5 d后各浓度组GFAP和TUJ-1的western blot表达，差异有统计学意义，*P＜0.05，**P＜0.01；C：外源性IGFBP-2诱导 5 d 各浓度组免疫荧光染色鉴定（Scale bar =200 μm）；D：外源性IGFBP-2诱导 5 d 后，TUJ-1阳性细胞明显减少和GFAP阳性细胞明显增多，差异有统计学意义，*P＜0.05，**P＜0.01

2.4 ERK1/2通路参与IGFBP-2诱导分化 为了探究ERK1/2通路在IGFBP-2诱导NSCs分化的中的作用，实验中取经外源性IGFBP-2处理5 min的实验组细胞，western blot检测总ERK1/2（t-ERK1/2）和活化ERK1/2 （p-ERK1/2）的变化。结果发现，经IGFBP-2处理后，p-ERK1/2在5 min内迅速升高，而t-ERK1/2无明显变化（图4）。证明ERK1/2参与了IGFBP-2的诱导分化过程。

图4 IGFBP-2加入OCM 前后，p-ERK1/2 、t-ERK1/2表达变化

3 讨论

为了探究IGFBP-2对NSCs分化的作用及其可能的作用通路，本实验将不同浓度的外源性IGFBP-2分别添加在无血清培养基和OCM中，观察其对NSCs分化的影响。结果证明，在无血清培养基中，IGFBP-2 对NSCs的分化无明显影响，而在OCM培养基中，IGFBP-2通过ERK1/2信号通路抑制NSCs向神经元分化并促进其向星形胶质分化。本实验为更全面的了解OCM诱导NSCs分化的作用提供了帮助，并为研究IGFBP-2介导的NSCs分化提供了必要的实验依据。

OECs能分泌大量营养因子，如神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）等等，而这些已知的营养因子对调节神经元的存活、轴突生长、突触可塑性和神经传导有着重要的作用［6，7］，体外实验证明，OCM既可以诱导NSCs向神经元分化，也可以诱导其向星形胶质细胞分化，出现差异性的原因，我们猜测可能与OECs分泌的某种蛋白有关。我们前期的研究结果表明发现，IGFBP-2在OECs中高表达。有文献报道，IGFBP-2能促进胶质瘤细胞的生长，增加其迁移能力和侵袭力［8］，敲除或沉默IGFBP-2基因后可以减缓疾病进程，促进胶质瘤的凋亡［9，10］，同时，患者IGFBP-2水平可预测其预后及生存期［11］。另外，IGFBP-2在诱导分化中也有重要作用，如诱导人骨髓间充质细胞向角膜细胞分化［12］、诱导成骨分化［13］、影响心肌分化［14］等。因此，我们推测IGFBP-2是影响NSCs分化的重要蛋白。

为了验证上述猜想，实验首先探究了单独的外源性IGFBP-2对NSCs分化的影响。免疫印迹和流式结果均显示，单独添加IGFBP-2对NSCs的分化无明显作用。而在OCM中，发现IGFBP-2可以促进NSCs分化成胶质细胞，且分化成胶质细胞的比例和IGFBP-2浓度呈正相关关系。因此，IGFBP-2可能与OCM中的某些蛋白达成协同作用，诱导NSCs向星形胶质细胞分化。

IGFBP-2 可以通过与胰岛素样生长因子（insulinlike growth factor，IGF）受体竞争性结合，调控IGF的生物学功能，还可以作为外分泌蛋白直接参与调控细胞的增殖、分化等过程［15］。IGF是在细胞的增殖分化、程序性死亡和转化中均有重要作用的因子。有研究发现，IGF可以促进NSCs增殖［16］，将IGF基因导入NSCs后，可以诱导NSCs向少突胶质细胞分化［17］，同时，还有研究表明，IGF在NSCs和MSC向神经元样细胞分化过程扮演着重要的角色［18，19］。可以发现，IGF对神经干细胞的功能是多样性的，但是尚无报道其可以诱导NSCs向星形胶质细胞分化，因此我们推断，本实验中IGFBP-2是通过非IGF依赖通路诱导NSCs向星形胶质细胞分化。

MAPK家族在调节细胞状态中至关重要，其成员中，ERK在细胞的分化和增殖中有着重要的作用。ERK是一组丝/苏氨酸蛋白激酶，能够被细胞外信号分子激活，继而将细胞表面信号转导到细胞核内，调节细胞的增殖和分化。有研究表明，IGFBP-2可以通过ERK信号通路促进胶质瘤细胞增殖和迁徙［8，20］。本研究证实IGFBP-2开始诱导NSCs 5 min后，p-ERK迅速增加，说明ERK通路与IGFBP-2的诱导分化有关。

综上所述，本研究结果证明了嗅鞘细胞分泌蛋白IGFBP-2对NSCs分化的作用，诱导效果和IGFBP-2的浓度呈正相关关系，且与ERK通路有关。而IGFBP-2 与OCM中哪些蛋白协同作用及其机制如何将有待我们进一步探讨。

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Effect of OECs secreted protein IGFBP-2 on differentiation of neural stem cells

Deng Yu-jia, Duan Da, Ge Li-te, Zhuo Yi, Yuan Ting, Yan Wei-ping, Huang Pei-qi, Lu Ming, Teng Xiao-hua
(Department of Neurosurgery, Second Affiliated Hospital of Hunan Normal University, Changsha 410003, China)

Objective To study the effect of OECs secreted protein IGFBP-2 on differentiation of neural stem cells. Methods OECs were isloated and cultured from the olfactory bulbs of 1-day-old postnatal mouse to prepare serum-free condition medium of OECs. After C17.2 NSCs were cultured with H-DMEM/F12 medium containing 10% FBS and the cell fusion reached 80%, the 3rd passage cells were induced by serum-free condition medium of OECs in the experimental group, by H-DMEM/F12 in the control group. Both the experimental group and control group were treated with 0, 100, 300, 500 ng/mL IGFBP-2. The growth condition of cells was observed with inverted microscope. After 5 days, analyzing expression patterns of neuroectodermal stem cell marker (Nestin), glial fibrillary acidic protein (GFAP), neuron specific class III beta tubulin (TUJ-1), ERK1/2 by western blot. GFAP and TUJ-1 positive cells were identified and counted by immunofluorescence staining. Meanwhile, flow cytometry were uesd to analyse the GFAP and TUJ-1 positive cells. Results In the control group, Western blot and flow cytometry analysis showed that there was no significant difference in the expression of GFAP and TUJ-1 between each concentration group. In the experimental group, Western blot analysis showed that With the increase of IGFBP-2concentration, the expression of GFAP was increased, the expression of TUJ-1 was decreased, and the expression of ERK1/2 increased rapidly after the addition of IGFBP-2. The immunofluorescence staining showed that GFAP positive cells increased and TUJ-1 positive cells decreased with the increase of IGFBP-2 concentration. Conclusion IGFBP-2 can promote the differentiation of NSCs into astrocyte induced by OCM in a dose-related way, and its mechanism is related to ERK1/2 pathway.

IGFBP-; Neural stem cells; Induced differentiation; Olfactory ensheathing cells

R329

A

1673-016X（2017）02-0004-05

2016-12-26

国家自然科学基金资助项目（81371358）；湖南省教育厅项目（15C0832）；湖南省自然科学基金（14JJ2060）

滕晓华，E-mail:txh1996@163.com