优选维Vitamin C测定方法在果蔬中的应用

陈 蓉，唐弼熙，李 敏，周虹延，张 佩，朱源志，苏 远，陈兴华，何纯莲

（湖南师范大学医学院，长沙410006）

优选维Vitamin C测定方法在果蔬中的应用

陈 蓉，唐弼熙，李 敏，周虹延，张 佩，朱源志，苏 远，陈兴华，何纯莲

（湖南师范大学医学院，长沙410006）

目的：为完善药品、食品中维生素C含量测定方法，指导合理摄入维生素C，正确推广健康饮食，找到一种准确快速测定维生素C含量的方法。方法：采用直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、荧光分光光度法测定维生素C的含量，系统比较维生素C含量测定的方法优缺点。结果：直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、荧光分光光度法（邻苯二胺体系、苯甲酸体系）测得维生素C片中维生素C的含量绝对误差分别为0.094mg/mL，0.095mg/mL，0.357mg/mL，0.120mg/mL，0.009mg/mL。结论：在苯甲酸体系，采用荧光分光光度法测得维生素C的含量准确度高，操作简易，方便应用于果蔬中 维生素C测定。

维生素C；荧光分光光度法；紫外分光光度法；2，6-二氯酚靛酚法

维生素C（VitaminC）是人体必需营养素，其药理及多种生理活性已得到证实［1-4］，作为纯粹药物或食品添加剂已被广泛应用。然而，研究表明过高剂量的VC（达2g/d）可能增加细胞DNA对H2O2或其它有害物质损害的敏感性［5］，同时对DNA可能产生多方面的损伤，如阻碍DNA修复合成、抑制DNA半保留复制、破坏核苷酸、断裂DNA、引起基因突变或染色体损伤等，因此建立快速准确测定VC的方法尤为重要。目前维生素 C含量的测定方法很多，有碘滴定法、高效液相色谱法、2，6-二氯酚靛酚法、极谱法、2，4-二硝基苯肼比色法、荧光分光光度法、电化学法、钼蓝比色法、过氧化酶法等。但这些方法都有一定的缺陷，如中国药典中采用的置换碘量法在测定深色样品时，准确度欠佳［6］；反相HPLC 法用于复杂基体的样品测定比较困难［7］；2，6-二氯酚靛酚法利用 DCIP 染料滴定果蔬提取液，滴定终点为红色，如果待测果蔬呈红色，提取液本身颜色会干扰滴定终点的观察，若对果蔬提取液进行脱色处理后利用该法测定深色果蔬中维生素C的含量，准确度和精密度依然欠佳。极谱法测定实验过程中所用汞蒸气有毒，且毛细管易堵塞［8］。酶分析法成本低廉，快速，且不需要对被分析物预先提纯，由于目前提高常规法自动化程度的趋势限制酶分析法的广泛应用［9］等。

本研究通过对维生素C含量测定方法进行系统比较研究，旨在找到一种准确快速维生素C分析方法，完善药典和食品中维生素C含量测定的国家标准，指导合理摄入维生素C，正确推广健康饮食。

1 资料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

1.1.1 仪器 紫外分光光度计：LabTech BlueStar，电热恒温水浴锅：DK-98-1A型，天津市泰斯特仪器有限公司，荧光分光光度计：LS-45/55（美国PE公司），高速冷冻离心机（thermo scientific FRESC017）。

1.1.2 试剂 抗坏血酸，无水乙酸钠，十六烷基三甲基溴化铵，冰醋酸，乙酸钠，硼酸，邻苯二胺，碘化钾，氧化砷，碳酸氢钠，2，6-二氯靛酚钠，盐酸（国药集团化学试剂有限公司），硫酸（株洲磺化玻有限公司），偏磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司），高岭土，苯甲酸（上海山浦有限公司），硫酸铜（天津市博迪化工有限公司）。实验所用试剂均为分析纯；实验所用水均为二次蒸馏水。

1.1.3 材料

1.1.3.1 维生素C 标准溶液，精密称定1.0g维生素C标准品，溶解，定容至1000mL容量瓶，得到1.0mg/mL维生素C标准溶液，备用。

1.1.3.2 果蔬样品 称水果（橙子，草莓等）样品各 100 g 加 100 mL偏磷酸-乙酸溶液，倒入研钵内研成匀浆。用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度，若呈红色，立即用偏磷酸-乙酸溶液稀释；若呈黄色或蓝色则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释。用干净纱布过滤一次，再用高速冷冻离心机离心取上清液，备用。

2 结果

通过直接碘量法、2，6-二氯酚靛酚法、紫外分光光度法、荧光分光光度法（邻苯二胺体系、苯甲酸体系），从精密度、准确度、检测限、回收率考察VC含量的测定方法，完善药典和食品中维生素C含量测定的国家标准，指导合理摄入维生素C，正确推广健康饮食。

2.1 直接碘量法 维生素C烯二醇基具有还原性，能被I2定量地氧化成二酮基，因而可用I2标准溶液直接测定。C6H8O6＋I2= C6H6O6＋2HI

2.1.1 方法 精确量取维生素C标准溶液1.00mL，加入10mL HAc（2mol/L）和1mL淀粉指示剂（10g/L），立即用0.05mol/Ll I2标准滴定溶液滴定至稳定的浅蓝色，即为终点。计算维生素C浓度。

2.1.2 结果性染料，可将还原态的维生素C氧化成脱氢维生素C，而染料本身从深蓝色被还原成无色的衍生物。2，6-二氯酚靛酚钠在酸性条件下呈红色。在滴定终点之前，滴下的2，6-二氯酚靛酚钠立即被还原成无色。当溶液从无色转变成微红色时，即为滴定终点。

表1 直接碘量法

2.2.1 方法 取2，6-二氯酚靛酚230mg，加入适量4%HCl使其溶解，加210mgNaHCO3，500 mL蒸馏配成标准溶液，使用前过滤，取续滤液。精确量取标准维生素C标准溶液5.00 mL，加入10 mL 2mol/L HAc 至锥形瓶中，用2，6-二氯酚靛酚标定，直至出现微红色30秒不退色为终点。计算VC的含量

2.2.2 结果

表2 2，6-二氯酚靛酚法

2. 3 紫外分光光度法 维生素 C 在紫外区 246.0nm 处有最大吸收，并且线性良好因此可以采用紫外分光光度法进行测量。

2.3.1 方法

2.3.1.1 建立标准曲线 取维生素C标准溶液10.00mL，用10%HCl定容至100.00mL，得维生素C标准储备液，从中取0.00mL、1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00mL，6.00mL维生素C标准储备液，定容至50.00mL，以蒸馏水做参比，在246.0nm处测定吸光度，绘制吸光度A与浓度C的标准曲线。

2.3.1.2 VC含量的测定 精确量取维生素C标准样品溶液1.00mL，用10%HCl定容至100.00mL，以蒸馏水做参比，波长246.0nm处测定吸光度。

2.3.2 结果

图1 紫外分光光度法标准曲线

表3 紫外分光光度法

2.4 荧光分光光度法-邻苯二胺体系 维生素C样品在酸性条件下经活性炭氧化成脱氢抗坏血酸，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，测定喹唔啉荧光值，计算维生素 C 的含量。

2.4.1 方法

2.4.1.1 建立标准曲线 精密量取10.00mL维生素C标准液至100.00mL容量瓶用蒸馏水稀释至刻度，加入2g活性炭，过滤，收集续滤液，作为标准氧化储备液，备用，精密量取1.00mL，2.00 mL，3.00 mL，4.00 mL标准氧化储备液，于50mL容量瓶中，加入5mL硼酸-醋酸钠（3%），用蒸馏水定容至50.00mL，摇匀，得标准氧化液，取上述标准氧化液5.00mL，加入邻苯二胺溶液（0.02%）5mL，混合反应35分钟，测定荧光强度。以不含邻苯二胺作为空白对照液，以浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标建立标准曲线。

2.4.1.2 含量的测定 精确量取10.00mL维生素C标准样品液置100.00mL容量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，加入2g活性炭，过滤，弃去初滤液，收集滤液，作为标准样品氧化储备液，备用。取1.00mL标准样品氧化储备液置于50mL容量瓶中，加入5mL硼酸-醋酸钠，用水稀释至刻度，摇匀，从中取1.00mL，加入邻苯二胺溶液5mL，混合反应35分钟，测定荧光强度，以不含邻苯二胺作为空白对照液。

2.4.2 结果

表4 荧光分光光度法-邻苯二胺体系

2.5 荧光分光光度法-苯甲酸体系

2.5.1 原理 维生素 C经Cu2+氧化为脱氢抗坏血酸，与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用。

2.5.2 方法

2.5.2.1 建立标准曲线 精密量取维生素C标准溶液5ml，加入适量10%盐酸溶液，加蒸馏水定容至

100.00 mL，得到5μg/mL VC稀释液。取5个50mL容量瓶，加入1.20mL硫酸铜（0.2%）、4.00mL十六烷基溴化铵溶液（0.06%）、4.00mL苯甲酸（0.01%），再向5个容量瓶中依次加入1.00mL，2.00mL，3.00mL，4.00mL，5.00 mL 维生素C稀释液后加入10.00mL磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，定容，摇匀。在35℃恒温水浴加热

30min，在发射波长417nm处测定荧光强度F，无VC试剂为空白F0，记为△F=F-F0。

2.5.2.2 含量的测定 精确量取维生素C标准样品溶液10mL，加入适量10%HCl，于100mL容量瓶中，定容，摇匀，得维生素C标准样品储备液。在50mL的容量瓶中加入1.20mL硫酸铜、4mL十六烷基溴化铵溶液、4mL苯甲酸，一定体积维生素C标准样品储备液，10mL磷酸氢二钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，定容。在35℃恒温水浴加热30min，冷却至室温，在发射波长417nm处测定荧光强度F，无VC试剂为空白F0，记为△F=F-F0。

2.5.3 结果

表5 荧光分光光度法-苯甲酸体系

图2 荧光分光光度法-苯甲酸体系

图3 荧光分光光度法-苯甲酸试验

2.6 橙子中VC含量测定，优选测定方法

表6 五种方法测定橙子比较结果（n=3）

经过五种方法的比较，我们发现荧光法（苯甲酸）体系测定VC含量准确度高，由此构建荧光法（苯甲酸）体系进行方法学验证。

2.7 荧光法（苯甲酸）体系方法学验证。

2.7.1 稳定性试验 将体系放置不同的时间进行测定。当放置 15min时，体系的荧光强度达到最大值并趋于稳定。

图4 稳定性试验

2.7.2 共存离子干扰试验 测定浓度为 2μg / m L的维生素 C时，当允许误差在5%以内时，共存离子的允许量如表7所示。

表7 共存离子允许量

2.7.3 工作曲线、线性范围、检出限 配制浓度为0.00，0.01，0.02，0.08，0.10，0.50，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00，10.00，12.00，14.00 u g/mL的系列维生素C标准工作溶液。按实验方法进行测定，以荧光强度F对维生素C的浓度。（μg/mL）进行线性回归，结果见图5。维生素C浓度在0.02 ～8.0 μg /mL范围内，与荧光强度呈良好的线性关系，线性回归方程为F = 124.18c+ 14.63相关系数为0 9998；检出限为0.0065μg/mI。

图5 工作曲线

2.7.4 精密度试验 对3.0 μg /mL的维生素C标准工作溶液测定6次，测定结果见表8。由表8可知，其相对标准偏差为 0. 12%。

表8 精密度试验结果

2.7.5 测定果蔬中VC 用荧光分析法（苯甲酸体系）以下五种果蔬中的维生素C进行测定，实验结果见表9。

表9 果蔬中VC测量结果

3 讨论

通过用多种方法对比和分析同一批次的维生素C含量，发现在苯甲酸体系中，荧光分光光度法测定维生素C具有操作简单，准确度高，检出限低，专属性强等优点，优选为维Vitamin C 测定方法，该法可应用于水果、蔬菜和药物中维生素C的检测，适于推广。

［1］ 汪东风. 食品化学 ［M］. 北京: 化学工业出版社, 2009 .

［2］ Fenech M. Chromosomal damage rate, aging and dims［J］. Acad Sci, 1998: 854: 23-36.

［3］ Jacobson EL, Shieh WM, Huang AC. Maping the role of NAD metabolism in prevention and treatment of carcinogenesis［J］. Mol Cell Biochem, 1999, 193: 59-74.

［4］ 张健, 曹恩华, 秦静芬, 等. 抗氧化剂对DNA损伤的保护作用机制的研究［J］. 生物物理学报, 1997, 13(1): 123-126.

［5］ 田晓华, 顾景范, 孙存普. 氧化应激与抗氧化维生素的作用［J］. 国外医学卫生学分册, 1996, 23(4): 229-233.

［6］ 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典［M］. 化学工业出版社, 2010, 901.

［7］ 孙振艳, 赵中一, 郭小慧, 等. 荧光分析法测定维生素C［J］. 化学分析计量, 2006, 4: 18-20.

［8］ 李润丰, 赵希艳, 高亚弟.2, 6-二氯靛酚反滴定法测定红色果蔬中还原型VC［J］. 营养学报, 2012, 05: 507-509.

［9］ 王佳露, 刘军. 极谱法检测芒果中的维生素C［J］. 齐齐哈尔医学院学报, 2008, 22: 2748.

［10］ L. Casella, 朱仕兄. 利用过氧化物酶分析果蔬维生素C的快速酶法［J］. 四川果树, 1993, 02: 43-45.

The preferentialvitamin Canalysis methods apply to fruits and vagetables

Chen Rong, Tang Bi-xi, Li Min, Zhou Hong-yan, Zhang Pei, Zhu Yuan-zhi, He Chun-lian
(Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

Objective To find a accurate and easier acceptable analysis methods, perfecting the pharmacopoeia and the national standard for the determination of vitamin C content in food, and to guide the reasonable intake of vitamin C, right to promote a healthy diet. Methods Comparing with five kinds of method systemly for determination of vitamin C content［2, 6-Dichlorophenol indophenol method, uv spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry(o-phenylendiamine), fluorescence spectrophotometry(benzoic acid)］, and analysis the advantages and disadvantages of each method. Results The results shows that 2, 6-Dichlorophenol indophenol method, uv spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry(o-phenylendiamine), fluorescence spectrophotometry(benzoic acid)measured the content of vitamin C in the vitamin C absolute error were 0.095mg/mL, 0.094mg/mL, 0.357mg/mL, 0.120mg/mL, 0.009μg/mL Conclusion The method of the most suitable for determination of vitamin C is fluorescence spectrophotometry(benzoic acid system), The vitamin Canalysis methods easy to be applied to fruits and vagetables.

vitamin C; fluorescence spectrophotometry; uv spectrophotometry; 2, 6-Dichlorophenol indophenol method

R652.1

A

1673-016X（2017）02-0186-04

2016-12-10

教育厅重点项目（NO.12A085）；湖南师范大学大学生创新实验通讯作者： 何纯莲，E-mail:chunlianhe68@163.com